Beyin Omurilik Sıvısında Nitrotirozin, Nitrat ve Nitrit için Tayin Yöntemi Geliştirilmesi

Abstract

Oksidatif stres, serbest radikallerin hücrede hasar oluşturdukları bir durumu tanımlamaktadır.Oksidatif stresin belirlenmesinde işaret molekülleri önem taşımaktadır. Tirozin molekülünün, aktif nitrojen türleri ile tepkimesi sonucunda oluşan 3-nitrotirozin bu işaret moleküllerinden biridir. Nitrat ve nitrit iyonları ise, bir serbest radikal olan NO'un inaktif metabolitleridir.Bu araştırmanın amacı, insan sağlığı üzerinde önemli etkileri olan oksidatif stresin belirlenmesinde işaret molekülü olarak kullanılan 3-nitrotirozin'in ve nitrat, nitrit iyonlarının beyin omurilik sıvısı içerisinde tayinini gerçekleştirebilecek yöntemler geliştirmektir. Bu amaçla voltametrik yöntem ile 3-nitrotirozin, kapiler elektroforez ile de nitrat ve nitrit iyonlarının tayini geliştirilmiştir. Her iki yöntem için kalibrasyon eğrilerinin hazırlanmasında, literatürde daha evvel rastlanmayan sentetik BOS kullanılmıştır.3-nitrotirozin'in voltametrik tayini için, adsoptif sıyırma kare dalga voltametrisi ve adsoptif sıyırma diferansiyel puls voltametrisi ile çalışılmış, kare dalga voltamogramların türevi de alınmıştır. Destek elektrolit olarak sentetik BOS içeren 100mM fosfat tamponu (pH 7,24) seçilmiştir. 3-nitrotirozin 500mV civarında (Ag/AgCl karşı) gözlenen indirgenme piki, sentetik veya gerçek BOS'tan kaynaklanan pikler nedeniyle engellendiğinden alt tayin sınırı istenen 10-9 M düzeyine inememiş, 10-7 M da kalmıştır.Kapiler elektroforez ile nitrat ve nitrit iyonlarının tayini düşük pH yürütücü tampon kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Düşük pH tamponu ile anorganik iyonların ayrılması son yıllarda kullanılmaya başlanmıştır. Yürütücü tampon olarak pH 3,5 fosfat tamponu (100mM), kolon sıcaklığı 27 oC seçilmiş, numune verme işlemi ise hidrodinamik yol ile 75s süreyle sıkıştırma yapılarak uygulanmıştır. Geliştirilen yöntem gerçek BOS örneklerine başarıyla uygulanmıştır.Anahtar Kelimeler: Serbest Radikal, Oksidatif Stres, Beyin Omurilik Sıvısı, 3-Nitrotirozin, Nitrat, NitritOxidative stress defines a condition that causes cell damage.The marker molecules are important for detecting oxidative stress. 3-NT is one of the marker molecules that is produced as a result of reaction of tyrosine molecule with active nitrogen species. On the other hand, nitrate and nitrite ions are inactive metabolites of the free radical NO.In this work it is aimed to develop methods for determination oxidative stress markers; 3-NT and NO3-, NO2- ions in cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose voltammetric method to determine 3-NT and capillary electrophoretic method to determine NO3- and NO2- were studied.For both methods, calibration curves were prepared in the presence of artificial CSF which was not seen in the literature before. For voltammetric analysis of 3-NT; adsorptive stripping square wave voltammetry and adsorptive stripping differential pulse polarography were studied. Besides the derivative of square wave voltamograms were also obtained. As supporting electrolyte artificial CSF containing phosphate buffer (100mM, pH 7,24) was chosen. The reduction peak potential of 3-NT was appeared at about 500mV (vs Ag/AgCl) was blocked by peaks those arise from artificial or real CSF. Due to this the limit of detection (LOD) was not at desired level (10-9 M) but achieved at 10-7 M level.Nitrate and nitrite ions were determined by using low pH running buffer solution. Separation of small inorganic ions with low pH buffer is novelty and used in recent years. As running buffer, phosphate solution (100mM, Ph 3,5) was selected and the capillary temperature was set to 27oC. Sample was introduced hydrodynamically for 75s by sample stacking. Developed method was successfully applied to real CSF.Keywords: Free Radikal, Oxidative Stress, Celebrospinal Fluid, 3-Nitrotyrosine, Nitrate, Nitrite