CRISPR-Combo Teknolojisi Kullanılarak Domates Bitkisinde Lateral Köklerin Artırılması

Abstract

Domates (Solanum lycopersicum), dünya genelinde üretimi ve tüketimi yaygın olan, insan sağlığı açısından önemli bir besin kaynağıdır. Ancak, küresel ısınma ve iklim değişikliği nedeniyle ortaya çıkan yüksek sıcaklık, kuraklık ve tuzluluk gibi abiyotik stres faktörleri, domates üretimini olumsuz etkilemektedir. Bu durum, hem ekonomik hem de sağlık açısından önemli olan domates bitkisinin korunması ve geliştirilmesi için yeni yaklaşımların gerekliliğini ortaya koymaktadır. Bu çalışmada, CRISPR Combo sistemi kullanılarak, domatesin abiyotik stres faktörlerine karşı dayanıklılığını artırmak hedeflenmiştir. Lateral kökler, bitkinin topraktan su ve besin alımını sağlayan önemli bitki yapıları arasında yer almaktadır. Lateral kökler, kuraklık ve tuzluluk stresi koşullarında, topraktaki suyun homojen olmayan dağılımına karşı daha nemli toprak bölgelerine yönelerek gelişimlerini artırmaktadır ve bu sayede bitkinin hayatta kalmasında rol oynamaktadırlar. Bu doğrultuda, lateral kök gelişimini negatif olarak düzenleyen Solyc03g121060 (IAA18) geni susturulmuş, pozitif olarak düzenleyen Solyc09g066260 (LBD16) geninin ifadesi ise aşırı düzeyde artırılmıştır. Genomu düzenlenmiş bitkiler üzerinde yapılan çalışmalar sonucunda, genom düzenlenen (T0) bitkiler ve bir sonraki nesil (T1) bitkilerde fizyolojik, morfolojik ve moleküler değişiklikler incelenmiştir. Bu kapsamda, bitki hatları üzerinde mutasyon analizleri, gen ifade düzeyleri ve kök gelişim parametreleri değerlendirilmiştir. Susturulan bitki hatlarında %70 - %90 arasında mutasyon oranları tespit edilmiştir. LBD16 geninin ifade seviyesinin kontrol koşullarına göre arttığı tespit edilmiştir. Kök gelişim parametreleri incelendiğinde ise genomu düzenlenmiş hatların kök gelişiminin kontrol bitkilerine kıyasla daha fazla olduğu belirlenmiştir. Bitki hatlarının tohumları kullanılarak osmotik stres uygulanmış ve genomu düzenlenmiş hatlar ile yabani tip (WT) hatlar ile kıyaslanmıştır. Bu karşılaştırmalar kapsamında, bitki çimlenme oranı, bitki boyu, oransal su içeriği, prolin ve MDA (malondialdehit) gibi stres parametreleri ölçülmüştür. Yapılan ölçümler sonucunda, genomu düzenlenmiş hatlarda kök gelişiminin arttığı, oransal su içeriğinin kontrol bitkilerine kıyasla yükseldiği ve prolin miktarının da anlamlı bir şekilde artış gösterdiği belirlenmiştir. Tüm bu sonuçlar istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Öte yandan, genomu düzenlenmiş hatlarda MDA miktarının kontrol grubuna kıyasla azaldığı gözlemlenmiş ve bu düşüş, 200 mM mannitol konsantrasyonunda istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Sonuç olarak, IAA18 geninin susturulması ve LBD16 geninin aşırı ifadesiyle artırılmış lateral kök gelişimine ve osmotik strese dayanıklı domates çeşiti üretilmiştir.Tomato (Solanum lycopersicum) is an important food source for human health, which is widely produced and consumed worldwide. However, abiotic stress factors such as high temperature, drought and salinity due to global warming and climate change adversely affect tomato production. This situation reveals the necessity of new approaches for the conservation and development of tomato plant, which is important both economically and in terms of health. In this study, CRISPR Combo system was used to increase the resistance of tomato against abiotic stress factors. Lateral roots are among the important plant structures that provide water and nutrient uptake from the soil. Under drought and salinity stress conditions, lateral roots increase their development by orienting towards more moist soil regions against the inhomogeneous distribution of water in the soil and thus play a role in plant survival. Accordingly, the Solyc03g121060 (IAA18) gene, which negatively regulates lateral root development, was silenced, while the expression of the Solyc09g066260 (LBD16) gene, which positively regulates lateral root development, was increased excessively. As a result of the studies on genome-edited plants, physiological, morphological and molecular changes in transgenic (T0) plants and next generation (T1) plants were examined. In this context, mutation analyses, gene expression levels and root development parameters were evaluated on plant lines. Mutation rates between 70% and 90% were detected in the silenced plant lines. The expression level of LBD16 gene was found to be increased compared to control conditions. When root growth parameters were analysed, it was determined that root growth of transgenic lines increased compared to control plants. Seeds of the plant lines were subjected to osmotic stress and transgenic lines were compared with wild type (WT) lines. Within the scope of these comparisons, stress parameters such as plant germination rate, plant height, proportional water content, proline and MDA (malondialdehyde) were measured. As a result of the measurements, it was determined that root growth increased, proportional water content increased and proline content increased significantly in transgenic lines compared to control plants. All these results were statistically significant. On the other hand, it was observed that the amount of MDA decreased in genome-edited lines compared to the control group and this decrease was statistically significant at 200 mM mannitol concentration. In conclusion, silencing of the IAA18 gene and overexpression of the LBD16 gene produced tomato variety with enhanced lateral root development and resistance to osmotic stress.