Synechocystıs Sp. Pcc 6803 Zwf Geninin Sistein Kodonlarının Mutasyonu ve Mutasyonların Glukoz-6-fosfat Dehidrogenaz (G6PDH) Aktivitesine Etkisi

Abstract

Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PDH) oksidatif pentoz fosfat (OPP) döngüsünün ilk enzimidir ve siyanobakteriyel karbon metabolizmasının düzenlenmesinde önemli bir kontrol noktasıdır. Işık/karanlık geçişlerinde enzim içi disüfit bağlarının oluşum ve yıkımına bağlı olarak aktivitenin düzenlendiği ileri sürülmektedir. Bu çalışmada Synechocystis sp. PCC 6803 zwf geninde olası disülfit bağ oluşumuna katılabilecek sistein kodonları değiştirilerek mutant enzimlerin redoks düzenlenme özelliklerinin incelenmesi hedeflenmiştir. Sistein mutant zwf genini içeren hücrelerin pozitif seçimi için genin aşağısına bir kanamisin direnç geni eklenerek pSG45 plazmiti oluşturuldu. pSG45 üzerinden genin 101., 187., 265. ve 445. pozisyonlarında yer alan sistein kodonları ayrı ayrı serin kodonuna dönüştürüldü. Her bir mutant plazmit Δzwf Synechocystis sp. PCC 6803 suşuna aktarıldı. Kanamisin direncine göre seçilen sistein mutantı genlerin kromozomda doğru pozisyona yerleştikleri teyit edildikten sonra fenotipik analizler yapıldı. Sürekli ışıkta üretilen yabani tip ve mutant suşlar arasında gelişme hızı bakımından bir farklılık olmadığı belirlendi. Doğal ışık/karanlık periyodunda da yabani tip ve sistein mutant kültürlerin gelişme hızı bakımından aynı olması mutant G6PDH'ın karanlıkta aktif olduğunu ve sistein mutasyonun aktiviteyi etkilemediğini işaret etmektedir. Yabani tip ve mutant suşlardan elde edilen enzim çözeltileri kullanılarak dört farklı pH'da yapılan G6PDH aktivite ölçümlerinde suşlar arasında farklılık gözlenmedi. Enzim çözeltilerine indirgenmiş DTT uygulandıktan sonra sistein mutant suşlarla yabani tip enzim aktiviteleri karşılaştırıldığında mutasyonun redoks modülasyonunu etkilemediği belirlenmiştir. Bu sonuçlar siyanobakteriyel G6PDH'ın aktivitesinin düzenlenmesinde disülfit bağının etkili olduğu görüşünü desteklememektedir.Glucose-6-phosphate dehydrogenase is the first enzyme of oxidative pentose phosphate (OPP) cycle and one of the most important control points of the regulation of cyanobacterial carbon metabolism. It is hypothesized that the enzyme activity is regulated through the construction/distraction of a disulphide bond between intrinsic cysteine residues during light/dark transitions. In this study it is aimed at investigating redox regulation properties of the mutant Synechocystis sp. PCC 6803 zwf gene with altered cysteine codons which may involve in disulphide bond formation. For positive selection of the cells containing cysteine mutant zwf gene, a plasmid, pSG45 was constructed by inserting a kanamycin resistance gene downstream of the zwf. Using the plasmid pSG45, cysteine codons in the positions 101, 187, 265 and 445 of zwf gene were changed to serine codons separately. Each mutant plasmid was transformed into zwf Synechocystis sp. PCC 6803 cells. After selecting against kanamycin resistance and conforming that the cysteine mutant genes replaced into precisely correct position in the chromosome, phenotypic analyses were carried out. No difference was found between wild-type and mutant strains in respect to growth rate in continuous light. Almost same growth rates of the mutant and wild-type cultures in natural light/dark circles indicated that the mutant G6PDH enzymes were active in the dark and cysteine mutation did not affect the activity. No difference was observed between strains in G6PDH activities in four different pH values using enzyme solutions of wild-type and mutant strains. Comparison of the reduced DTT treated wild-type and mutant enzyme activities showed that the mutations did not affect redox modulation of the enzyme. The results of this study do not support the hypothesis that disulphide bonds play a role in the regulation of G6PDH activity in cyanobacteria.