Streptomyces Clavuligerus'ta Lysa Geninin Çoklu İfadesi ve Sefamisin C Biyosentezi Üzerine Etkisi

Abstract

Streptomyces clavuligerus tıbbi açıdan oldukça değerli bir β laktam antibiyotiği olan sefamisin C'yi, bir β-laktamaz inhibitörü olan klavulanik asidi ve tunikamisin gibi çeşitli sekonder metabolitleri üretmektedir. Bu sekonder metabolitlerden sefamisin C; ikinci kuşak bir sefalosporin antibiyotiği olup sefalosporin çekirdeğinin C-7 pozisyonunda bir metoksil grubunun varlığı dolayısıyla penisiline dirençli bakterilere karsı etkilidir. S. clavuligerus'da sefamisin C biyosentezi için gerekli öncülllerden biri olan L-α-aminoadipik asidin oluşumu için gereken L-lizin, aspartat metabolik yolundan elde edilmektedir. Bu çalışmada, S. clavuligerus NRRL3585'in aspartat yolağında L-lizin oluşumunu katalizleyen mezo-diaminopimelik asit (DAP) dekarboksilaz (E.C.4.1.1.20) enzimini kodlayan lysA geni gliserol promotoru taşıyan pSPG çoklu ifade vektörüne klonlanmış ve konjugasyonla S. clavuligerus hücrelerine aktarılmıştır. lysA geninin hücrede çoklu ifadesinin transkripsiyonel ve translasyonel seviyede sefamisin C biyosentezi üzerine olan etkisi qRT-PCR ve biyoassay çalışmaları ile belirlenmiştir. Rekombinant S. clavuligerus pCOlysA2'de volumetrik ve spesifik sefamisin C üretimi hem vektör kontrolü (S. clavuligerus pSPG) hem de yabanıl suş (S. clavuligerus NRRL3585) ile karşılaştırıldığında artış göstermiştir. T24 ve T36'da gen ifadelerine bakıldığında, gerek lysA geninin gerekse de sefamisin C gen kümesindeki genlerin ifadelerinde genel bir artış sözkonusudur. Sefamisin C biyosentezinde hız sınırlayıcı olan lysA'nın ifadesinin artırılması rekombinant suşda klavulanik asit ve tunikamisin üretimlerinde de artışa neden olmuştur. Elde edilen bulgular, lysA geninin S. clavuligerus'daki sefamisin C biyosentezinin endüstriyel ölçekte olabilmesi için üzerinde çalışılabilecek potansiyele sahip olduğunu göstermektedir.

Streptomyces clavuligerus produces various medically important secondary metabolites such as a highly potent β-lactam antibiotic cephamycin C, a β-lactamase inhibitor clavulanic acid and tunicamycin. Of these secondary metabolites, cephamycin C, is a second generation cephalosporin antibiotic and is potent against penicillin-resistant bacteria due to the presence of a methoxyl group at the C-7 position of the cephalosporin core. L-lysine required for the formation of L-α-aminoadipic acid, a precursor in cephamycin C biosynthesis in S. clavuligerus, is obtained from the aspartate metabolic pathway. In this study, lysA gene encoding meso-diaminopimelic acid (DAP) decarboxylase (EC 4.1.1.20) enzyme which catalyzes the formation of L-lysine in the aspartate pathway in S. clavuligerus NRRL3585 was cloned into the pSPG multiple expression vector carrying glycerol inducible promoter, and transferred to S. clavuligerus cells by conjugation. The effect of multicopy lysA expression in the cell in cephamycin C biosynthesis at the transcriptional and translational level was determined by qRT-PCR and bioassay studies. The volumetric and specific cephamycin C production in the recombinant S. clavuligerus pCOlysA2 has been increased in comparison to both vector control (S. clavuligerus pSPG) and wild-type strain (S. clavuligerus NRRL3585). When the relative gene expression at T24 and T36 were examined, a general increase has been detected in the expression of lysA, and of the genes in the cephamycin C gene cluster. Increasing the expression of lysA, which is the rate limiting step in the cephamycin C biosynthesis, also resulted in an increase in the production of clavulanic acid and tunicamycin in the recombinant strain. The findings show that the lysA gene has the potential on further studies for industrial scale production of cephamycin C in S. clavuligerus.