Synechococcus Sp. Pcc7942 Glukoz-6-fosfat Dehidrogenaz Enziminin Işığa Bağlı Düzenlenmesinde Disülfit Bağlarının Rolünün Araştırılması

Abstract

m ÖZET SYNECHOCOCCUS SP. PCC7942 GLUKOZ-6-FOSFAT DEHÎDROGENAZ ENZİMİNİN IŞIĞA BAĞLI DÜZENLENMESİNDE DİSÜLFİT BAĞLARININ ROLÜNÜN ARAŞTIRILMASI Bu çalışmada Synechococcus sp. PCC7942 glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PDH) enzimiııin ışığa bağlı düzenlenmesinde disülfît bağlarımn rolünün araştırılması için in vitro enzim analizleri ve Azw/mutant hücre elde edilmesi hedeflenmiştir. Öncelikle enzimin düzenlenmesinde disülfît bağlarmın rolünün olup olmadığının anlaşılması hedeflendi. In vitro enzim analizleri için Synechococcus sp. PCC7942 hücrelerinden elde edilen süpernatantm DTT varlığında ve yokluğunda G6PDH aktivitesi gözlemlendi. Bunun için farklı DTT konsantrasyonlarında enzim aktivitesinin zamana bağlı olarak nasıl değişiklik gösterdiği takip edildi. Analizler sonucunda DTT'nin enzim aktivitesini etkilediği ve bu etkinin 50 mM konsantrasyonda 30 dk sonunda maksimuma ulaşarak %51.22'lik bir azalmaya neden olduğu belirlenmiştir, in vitro enzim analizleri sonucunda Synechococcus sp. PCC7942 G6PDH aktivitesinin DTT'den etkilendiğine ve dolayısıyla disülfît bağlarının enzimin ışığa bağlı düzenlenmesinde rolü olabileceği hipotezinin bu organizma için de geçerli olduğuna karar verildi. Synechococcus sp. PCC7942 zwf geni içinde yer alan iki sistein kodonunu değiştirmek üzere yürütülecek çalışmalarda gerekli bir Azwf mutant elde etmek için çalışmalar yürütüldü. Öncelikle pUC18 klonlama vektörünün Sphl bölgesi silinerek Nrul ve Sphl tanıma bölgesi taşımayan bir vektör (pUC181) elde edildi. Bu vektör içine 2.9 kb'lık Synechococcus sp. PCC7942 zw/fragmenti bağlanarak pSGll vektörü elde edildi. Bu vektörün NrullSphl kesimi ile iki adet sistein kodonunu da içeren zwf gen bölgesi vektörden uzaklaştınlabilecektir. Uzaklaştırılan bölgeye interpozon omega (Q)'nın ligasyonu çalışmaları yürütüldü. Muhtemelen yapışkan Sphl ucunun etkili olarak doldurulamaması nedeniyle kabul edilebilir bir sürede bu ligasyon gerçekleştirilemedi. Bu zorluğu aşmak üzere Sphl tanıma bölgesinin yanma oligonükleotit-yönlendirilmiş mutasyon yöntemiyle ikinci bir Nrul tanıma bölgesi eklenmesi stratejisi geliştirildi. Halen bu çalışmalar devam etmektedir. Anahtar Kelimeler: Synechococcus sp., zwf glukoz-6-fosfat dehidrogenaz, disülfît bağlanIV ABSTRACT AN INVESTIGATION ON THE ROLE OF DISULPHIDE BONDS IN THE LIGHT- DEPENDENT REGULATION OF GLUCOSE-6-PHOSPHATE DEHYDROGENASE OF SYNECHOCOCCUS SP. PCC7942 In this study, in vitro enzyme analyses and production of a Azwf mutant was aimed for understanding the role of disulphide bonds in the light-dependent regulation of glucose- 6-phosphate dehydrogenase enzyme of Synechococcus sp. PCC7942. Initially it was aimed to understand whether disulpide bonds have a role in the regulation of the enzyme. For in vitro enzyme analyses, G6PDH activity was assayed with or without DTT using supernatants from the cells of Synechococcus sp. PCC7942. For this, how the enzyme activity was changed in different DTT concentrations were observed applying various time courses. Results of the analyses showed that DTT affected the activity and this effect reached a maximum rate at 50 mM DTT in 30 minutes resulting a decrease of 51.22%. This result implied that the G6PDH of Synechococcus sp. PCC7942 affected by DTT, and consequently the hypothesis suggesting that disulphide bonds have a role in the light-dependent regulation of the G6PDH was also applicable for this strain. Studies to produce a Azwf mutant Synechococcus sp. PCC7942 needed for the studies to change two cysteine codons of the zwf gene of the strain were conducted. Firstly, a vector, pUC181, which was not have Nrul and Sphl recognition sites, was produced by deleting the Sphl site of the cloning vector pUC18. A 2.9 kb Synechococcus sp. PCC7942 zw/fragment was ligated into the vector pUC181 yielding the pSGll. The zwf region carrying two cysteine codons could be removed digesting the vector pSGll with NrullSphl. Studies carried out to ligate the Q interposon into the removed region of pSGll.This ligation could not be achived İn an acceptable time probably because of uneffective end filling of the Sphl site. To overcome this difficulty an alternative strategy was applied involving in the addition of a second Nrul site next to Sphl site by oligonucleotide-directed mutagenesis. This study is continued. Keywords: Synechococcus sp., zwf, glucose-6-phosphate dehydrogenase, disulphide bonds.