Kisspeptin'nin İnfertil Hastaların Granüloza Hücreleri Üzerine Etkisinin Araştırılması

Abstract

Polikistik over sendromu (PKOS) kadın infertilitesinin en sık sebeplerinden biri olarak bilinmektedir. PKOS'da foliküler gelişimin ileri aşamalarının sekteye uğradığı ve bu durumun granüloza hücrelerindeki apoptozis artışı ve proliferatif belirteçlerde düşüş ile bağlantılı olabileceği düşünülmektedir. Kisspeptin, hipotalamo hipofizier gonadal aks (HHG aksı) üzerindeki etkileri keşfedilmiş olan peptid bir hormondur. Bu çalışmada PKOS ve PKOS dışı infertilite tanısı almış gönüllülerden elde edilmiş granüloza hücrelerine doğrudan in vitro kisspeptin uygulanmıştır. Uygulamanın granüloza hücrelerinde hayatta kalım ve apoptozis ile ilgili genler de dahil olmak üzere granüloza hücre fonksiyonlarıyla ilişkili çeşitli genlerin ifade düzeylerine etkisi incelenmiş, ayrıca hücre içi kalsiyum düzeyine olan etkisi de araştırılmıştır. Çalışma grupları, 16 tanesi PKOS ve 16 tanesi de PKOS dışı infertilite tanısı almış toplam 32 gönüllü ile oluşturulmuştur. Her bir gönüllüden elde edilmiş olan örneklerin yarısına Kisspeptin-54 uygulanmış ve diğer yarısına uygulanmamıştır. Böylece Kontrol, Kontrol-Kiss, PKOS ve PKOS-Kiss grupları oluşturulmuştur. Alınan serum ve foliküler sıvı örneklerinde de biyokimyasal yöntemlerle Kissepeptin-54 düzeyi tayini yapılmıştır. Elde edilen granüloza hücre örneklerinde qRT-PCR yöntemi ile KISS1, KISS1R, BCL-2, CASPASE-3, FSHR, LHCGR, STAR, ESR1, ESR2, INHBA genlerinin ekspresyon düzeyleri belirlenmiştir. Hücre içi kalsiyum konsantrasyonları floresan spektrofotometre yöntemi ile ölçülmüştür. PKOS'lu gönüllülerden elde edilmiş olan serum ve foliküler sıvı örneklerinde daha yüksek Kisspeptin-54 düzeyi belirlenmiş, granüloza hücrelerinde ise daha düşük hücre içi kalsiyum konsantrasyonu tespit edilmiştir. PKOS grubu granüloza hücrelerinde CASPASE-3 geni ifadesinde artış ve BCL-2 geni ifadesinde düşüş, in vitro Kisspeptin-54 uygulaması sonrası ise CASPASE-3 ifadesinde düşüş, BCL-2 ifadesinde yükseliş gözlenmiştir. ESR1 ve ESR2 gen ifadeleri PKOS grubunda yüksek bulunmuş ve Kisspeptin-54 uygulaması ile arttığı tespit edilmiştir. FSHR ifadesi PKOS grubunda anlamlı düzeyde düşük, LHCGR ifadesi ise anlamlı düzeyde yüksek çıkmıştır. Kisspeptin-54 uygulaması ile FSHR ifadesinde Kontrol grubunda, LHCGR ifadesinde PKOS grubunda anlamlı artışlar tespit edilmiştir. Kisspeptin-54 uygulaması ile PKOS gurubunda anlamlı düzeyde STAR geni ifadesinde artış görülmüştür. İn vitro Kisspeptinin uygulamasının granüloza hücrelerin hayatta kalımına ve diğer genlerin ifadesine anlamlı olarak etki ettiği gözlenmiştir.Polycystic ovary syndrome (PCOS) is known as one of the leading causes of female infertility. It is thought that follicular maturation is disrupted in PCOS and this can be associated with increase of apoptosis and decrease of proliferation in granulosa cells. Kisspeptin is a peptide hormone whose effects on the hypothalamo hypophysial gonadal (HHG) axis were discovered. In this study, it was aimed to investigate the effects of direct in vitro Kisspeptin-54 application on the gen expressions in granulosa cells of PCOS and Non-PCOS infertile women groups. Also, the intracellular calcium levels in the granulosa cells were investigated. The study groups were comprised of 16 PCOS and 16 non-PCOS, a total of 32 patients. For samples obtained from each patient, half was applied with direct kisspeptin-54 and half was not. Thus, the groups of Control, Control-Kiss, PCOS and PCOS-Kiss were formed. In the serum and follicular fluid samples obtained from patients, Kisspeptin-54 level was measured via biochemical methods. In the obtained granulosa cells, the gene expressions of KISS1, KISS1R, BCL-2, CASPASE-3, FSHR, LHCGR, STAR, ESR1, ESR2, INHBA were determined by qRT-PCR method. The intracellular calcium concentrations were measured by fluorescent spectrophotmetry. In the serum and follicular fluid samples obtained from PCOS patients, higher Kisspeptin-54 levels were detected. In the granulosa cells obtained from PCOS patients, lower intracellular calcium levels were measured. In the PCOS granulosa cells, higher CASPASE-3 and lower BCL-2 expressions were noted. With in vitro Kisspeptin-54 application, the expression level of CASPASE-3 were lowered and BCL-2 were raised. The expression of ESR1 and ESR2 were higher in PCOS and they increased with Kisspeptin-54 application. FSHR expression were lower in PCOS and LHCGR expression is higher. The expresions of FSHR were raised in Control-Kiss group and the expression of LHCGR were raised in PCOS-Kiss group with Kisspeptin-54 treatment. With Kisspeptin-54, the expression of STAR increased. It was indicated that in this study that in vitro kisspeptin application affects the expression levels of the genes associated with proliferation and apoptosis and some other genes in granulosa cells.