İnsan Retinal Pigment Epitelyal Hücre Hattında Resveratrol ve Nikotinamid'in Hücre Çoğalması ve Apoptozise Etkilerinin Araştırılması

Abstract

Yaşa bağlı makula dejenenasyonu (YBMD) metabolik, fonksiyonel, genetik ve çevresel faktörlerin etkilediği, patogenezinde oksidatif stres kaynaklı retinal pigment epitelyum (RPE) hasarın sorumlu olduğu ve özellikle kuru tipinde kesin bir tedavi yöntemi olmayan bir hastalıktır. Muhtemel tedavi seçeneği olarak, antioksidan, antiapoptotik ve antiinflamatuar özellikleri aracılığıyla mitokondriyal disfonksiyonu azaltarak aditif yada sinerjik etkisi olabileceği düşünülen resveratrol ve nikotinamid'in kuru tip YBMD modelindeki potansiyel etkinliğinin gösterilmesi amaçlandı. Bu çalışmada YBMD modeli oluşturmak için, sağlıklı RPE hücreler standart seviyede oksidatif strese maruz bırakıldı. Etken maddelerin belirlenen konsantrasyonlarda ve sürelerde ayrı ayrı ve kombinasyon halinde sağlıklı ve oksidatif strese maruz bırakılmış hasarlı RPE hücrelerine uygulanmasının hücre çoğalmasına olan etkisi CCK-8 analizi ile ölçüldü ve aynı parametrelerin apoptoz analizi ise flow sitometri yöntemi ile belirlendi. Bu analizlerde, her iki etken madde için en iyi sonucu veren etkili dozlar ve kombine dozun, SIRT1 gen ifade düzeyi üzerindeki etkisi Kantitatif Real-Time PCR yöntemi ile belirlendi. Veriler istatistiksel açıdan değerlendirildi. Etken maddeler ve kombine doz seçenekleri arasında, YBMD modelindeki progresyonun azalması yönünde, en etkili hücre viabilite (p<0,001), hücre proliferasyon indeksi (p<0,001) ve hücre apoptoz+nekroz değerlerinin (p<0,001) 72.saat inkübasyon süresinde 100µmol/L resveratrol+1mM/L nikotinamid kombine doz uygulamasında gerçekleştiği tespit edildi. İlgili kombine dozun sağlıklı RPE hücre grubunda sitotoksik etki göstermediği (p>0,05) ve yara onarımını sağlayacak düzeyde proliferatif etki sağladığı (p=0,01) görüldü ve ayrıca hasarlı RPE hücre grubunda SIRT1 gen ekspresyon seviyesini arttırdığı belirlendi (p<0,001). Araştırmamızda etken maddelerin ayrı ayrı uygulamalarına kıyasla kombine doz uygulamalarının, hücre proliferasyonunu, hücre viabilitesini ve SIRT1 gen ifade düzeyini etkili bir şekilde arttırdığı ve hücre apoptoz+nekroz oranını ise etkili bir şekilde azalttığı görüldü ve iki etken maddenin sinerjik etki gösterdiği belirlendi. Proje araştırmamız, ilgili kombine dozun kuru tip YBMD modelindeki etkisini araştıran ilk çalışmadır. Anahtar Sözcükler: Resveratrol, Nikotinamid, Kuru tip yaşa bağlı makula dejenerasyonu

Age-related macular degeneration (AMD) is a disease that is affected by metabolic, functional, genetic and environmental factors, oxidative stress-induced retinal pigment epithelium (RPE) damage is responsible in its pathogenesis, and there is no definitive treatment method, especially in the dry type. As a possible treatment option, it was aimed to demonstrate the potential efficacy of resveratrol and nicotinamide which are thought to have additive or synergistic effect by reducing mitochondrial dysfunction through their antioxidant, antiapoptotic and antiinflammatory properties in the dry type AMD model. In this study, healthy RPE cells were exposed to standard levels of oxidative stress to form the AMD model. The effect of the application of the active substances separately and in combination at the determined concentrations and times on cell proliferation of healthy and oxidative stress damaged RPE cells was measured by CCK-8 assay and apoptosis analysis of the same parameters was determined by flow cytometry method. In these analyzes, the effective doses that gave the best results for both active substances and the combined dose on SIRT1 gene expression level were determined by Quantitative Real-Time PCR method. Data were evaluated statistically. Among the active substances and combined dose options, the most effective cell viability (p<0.001) cell proliferation index (p<0.001) and cell apoptosis+necrosis values (p<0.001) in the direction of decreasing progression in the AMD model were determined to be occured in the combined dose application of 100µmol/L resveratrol+1mM/L nicotinamide at the 72nd hour incubation period. It was observed that the relevant combined dose did not show cytotoxic effect in the healthy RPE cell group (p>0.05) and provided a proliferative effect at a level that would provide wound repair (p=0.01) and it was also determined that it increased SIRT1 gene expression level in the damaged RPE cell group (p<0.001). In our study, it was observed that the combined dose application of the active substances effectively increased cell proliferation, cell viability and SIRT1 gene expression level and effectively decreased cell apoptosis+necrosis rate compared to their separate applications and it was determined that the two active ingredients showed a synergistic effect. Our project research is the first study to investigate the effect of the relevant combined dose in a dry type AMD model. Keywords: Resveratrol, Nicotinamide, Dry type age related macula degeneration