Sığırlarda İn Vitro Embriyo Üretiminde Olgunlaştırma Sıcaklığı ve Antioksidan Kullanımı

Abstract

Bu çalışma, sığır oositlerinin in vitro olgunlaştırma (IVM)'sında uygulanan 36,5 °C ve 38,5 °C inkübasyon sıcaklıklarının ve in vitro embriyo kültürü (IVC)'ne antioksidan ilavesinin, oosit olgunlaşması, embriyonik gelişim, blastosistlerin kalitesi, çapı ve hücre sayıları üzerine olabilecek etkilerinin belirlenmesi amacıyla yapılmıştır. Sığır ovaryumlarından elde edilen oositler iyi ve orta kalite olarak sınıflandırılıp %10 FCS eklenmiş bikarbonat tamponlu TCM–199'da 36,5 veya 38,5°C'de ve % 5 CO2 içeren nemlendirilmiş ortamda 22 saat IVM'ye alınmışlardır. Sonrasında oositlerin kumulus genişlemeleri, 1. kutup cisimciği ve nükleer boyama ile nükleer olgunlaşmaları (metafaz II; MII) belirlenmiştir. İn vitro fertilizasyon (IVF) sonrasında muhtemel zigotlar antioksidan içeren (1mM GSH ve 1500 IU SOD karışımı) ve içermeyen SOFaa İVC medyumlarına rasgele aktarılmış ve 38,5°C'de, % 5 CO2 içeren nemlendirilmiş ortamda 8 gün boyunca kültür edilmişlerdir. Embriyonik gelişim kültürün 3, 5, 7 ve 8. günlerinde gözlemlenmiştir. IVM'de uygulanan inkübasyon sıcaklıkları arasında sığır oositlerinin olgunlaşma parametreleri bakımından bir farklılık tespit edilmemiştir. IVM sıcaklıkları IVF sonrası embriyoların gelişim seviyesini etkilemezken, IVC'ye antioksidan ilavesi embriyonik gelişim seviyesini arttırmıştır (P<0,05). 36,5 °C'de olgunlaştırılan iyi kalitedeki oositlerden elde edilen ve IVC'ye antioksidan ilave edilen embriyolar daha fazla iç hücre kitlesi hücre sayısına sahip olmuşlar (P<0,05) ve 38,5 °C'de olgunlaştırılan iyi kalitedeki oositlerden elde edilen ve IVC'ye antioksidan ilave edilen embriyolar daha fazla trophektoderm hücresine ve toplam hücre sayısına sahip olmuşlardır (P<0,05). Farklı IVM sıcaklıkları blastosist çapını ve kalitesini etkilemezken, iyi kalitedeki oositlerden elde edilen embriyoların IVC'ye antioksidan ilavesi blastosist çapını ve kalitesini arttırmıştır (P<0,05). Bu çalışmanın sonuçları iyi kalitede oositler kullanıldığında IVM sıcaklığının in vivo şartları temsil eden sıcaklığa düşürülmesinin (36,5 °C) oosit olgunlaşması ve embriyonik gelişim üzerine olumsuz etkilere sahip olmadığını göstermiştir. Ayrıca sığır oositlerinin 36,5 °C inkübasyon sıcaklığında kültüre alınması nükleer olgunlaşmanın tamamlanması ve sonraki embriyonik gelişim için uygun bir termal çevre sağlayabilir. Dahası oositlerin düşük sıcaklıkta olgunlaştırılmaları antioksidan kullanmaksızın ileriki embriyonik gelişimin iyileştirilmesi için kullanışlı bir araç olabilir.The aim of the study was to investigate the effect of 36.5 °C and 38.5 °C incubation temperatures in in-vitro maturation (IVM) and use of antioxidants in in-vitro embryo culture (IVC) on in vitro maturation, embryo development, diameters and cell numbers of blastocysts. Oocytes obtained from bovine ovaries were classified as good and moderate quality and were subjected to IVM in bicarbonate-buffered TCM–199 supplemented with 10% FCS for 22 hours with a humidified 5% CO2 in air at either 36.5 or 38.5 °C. Cumulus expansion, the first polar body and nuclear maturation (at metaphase II) determined by nuclear staining of oocytes were determined at the end of in vitro maturation period. After in vitro fertilization (IVF), presumptive zygotes were allocated randomly into SOFaa IVC medium with or without antioxidant (a mixture of 1mM GSH and 1500 IU SOD) and were cultured in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air at 38.5°C for 8 days. Embryo developments were evaluated on days 3, 5, 7 and 8 of culture. There were no significant differences between incubation temperatures in IVM in terms of maturation parameters. While incubation temperatures in IVM had no effects on the level of development of the embryo, addition of antioxidants in IVC increased the level of development of the embryo (P<0.05). Although embryos from good quality oocytes maturated at 36.5 °C and cultured in media supplemented with antioxidants in IVC had higher cell numbers in inner cell mass (P<0.05), embryos from good quality oocytes maturated at 38.5 °C and cultured in media supplemented with antioxidants in IVC had higher total cell and trophectoderm cell numbers (P<0.05). While incubation temperatures in IVM had no effect on diameters of blastocysts, embryos from good quality oocytes cultured in media supplemented with antioxidants in IVC had higher diameters of blastocysts and embryo quality (P<0.05). The results of present study show that decreasing the in vitro maturation temperature (36.5 °C) that represent in vivo conditions did not have dramatic effects on oocytes maturation and embryo development when good quality oocytes were used. Culture of bovine oocytes during in vitro maturation at 36.5 °C incubation temperature may provide a suitable thermal environment for the completion of nuclear maturation and subsequent embryo development. Moreover under certain circumstances oocyte maturation at a lower temperature could be useful as a tool without antioxidants to improve subsequent embryo development.