Denizel Ortamlarda Plastiklerin Parçalanma Süreçlerini Hızlandıracak Bir Kütinolitik Esteraz Enziminin Fonksiyonel Metagenomik Yöntemlerle Keşfi

Abstract

Yaşadığımız yüzyılın en büyük sorunlarından biri plastikler ve diğer sentetik esterlerin yaygın kullanımından doğan çevre kirliliğidir. Sucul ekosistemlerdeki mikroorganizmalar mevcut ortamın şartlarına ayak uydurma kapasitesi yüksek canlılardır ve farklı tip esterleri karbon ve enerji kaynağı olarak kullanabilirler. Buna rağmen, literatürde plastikler ve diğer sentetik esterlerin parçalanmasında kullanılabilecek mikroorganizma temelli esteraz/kütinaz enzimleri sınırlıdır. Ancak, kültürel yöntemlerle izole edilemeyen çok sayıda mikroorganizmanın da benzer enzimleri üretme potansiyelinin olabileceği tahmin edilmektedir. Bundan dolayı, sunulan tez kapsamında fonksiyonel metagenomik yöntem kullanılarak ülkemiz kumsallarında atılı plastik parçaları ile ilişkili mikroorganizmaların genlerinin taranması ile denizel ortamlarda kararlı kütinaz/esteraz enzimlerinin keşfi hedeflenmiştir. Bu kapsamda; 12 farklı kumsaldan atık plastik parçaları toplanmış ve her alan için 30-40 kb'lık DNA parçaları içeren klonlardan oluşan metagenomik kütüpaneler hazırlanmıştır. Katı besiyerinde gerçekleştirilen taramalar neticesinde 24 klonun hem tributirin (Trb) hem de polikaprolakton (PCL) parçalama yeterneği olduğu tespit edilmiştir. Kütinolitik enzim üretme potansiyeli en yüksek olan yani p-nitrofenil-bütirat (pNP-B) karşında diğer pNP-esterlerden daha yüksek özgünlüğe sahip hücre içi ve hücre dışı protein çözeltilerinin elde edildiği klon belirlenmiştir. Bu klondan ekstrakte edilen fosmid DNA SmaI restriksiyon enzimi ile 2-6 kb aralığındaki fragmanlara parçalanmıştır. Elde edilen DNA parçaları pUC19 vektörüne klonlanarak E.coli DH5α hücrelerine aktarılmıştır. Alt klonlardan hem Trb hem de PCL parçalama yeterneği olanı seçilerek içerdiği DNA parçasındaki potansiyel enzime ait açık okuma çerçevesi belirlenmiş ve gen çoğaltılarak pET20b(+)'ya klonlanmış ve E. coli BL21(DE3)' de ifade edilmiştir. İfade edilen enzim saflaştırıldıktan sonra maksimum aktivite gösterdiği sıcaklık ve pH'nın sırasıyla 30 ve 7.0 olduğu tespit edilmiştir. Bununla birlikte, enzimin NaCl varlığında aktivitesi ve kararlılığı belirlenmiştir. Sonuç olarak, gerçekleştirilen tez kapsamında denizel ortamlarda aktif olabilecek bir kütinolitik esterazın heterolog üretimi sağlanmıştır.In the century we live one of the biggest problem of world face is arising the widespread use of plastics and other synthetic esters. Microorganisms lives in aquatic ecosystems with a high capacity to adapt to the conditions of the current environment as they can adapt to use different carbon source as energy source. However, microorganism-based enzymes responsible to degradation of plastic and other synthetic esters which is not studied extensively. Although, many microorganisms cannot be isolated by cultural methods may have the potential to produce similar enzymes. Therefore, as a topic of thesis, we aimed to discover stable cutinase/esterase enzymes in marine environments by screening the genes from microorganisms which associated with discarded plastic pieces on the beaches of our countryside by using functional metagenomic methods. In this context, plastic pieces collected from 12 different beaches of country and metagenomic libraries consisting of clones containing 30-40 kb DNA fragments for each area designed. The libraries scanned against specific substrate and 24 clones that capable of cleaving both tributyrin (Trb) and polycaprolactone (PCL). After then, clones show high specificity of pNP-ester activity measured against p-nitrophenyl-butyrate (pNP-B). The fosmid DNA extracted from this clone was fragmented to 2-6 kb with SmaI restriction enzyme. The DNA fragments cloned into pUC19 vector and transformed E.coli DH5α cells. The open reading frame of the DNA fragment determined for subclones degrades both Trb and PCL. This gene amplified and cloned pET20b(+), as final expressed in E. coli BL21(DE3). For ppurified enzyme the temperature and pH at which it showed maximum activity were 30oC and 7.0, respectively. However, the activity and stability of the enzyme in the presence of NaCl measured. Within the scope of this thesis, heterologous production of a cutinolytic esterase that can be active in marine environments has been provided.