Halofilik Bakterilerde Tuz Direncini Sağlayan Moleküler Mekanizmaların ve Endüstriyel Enzim Üretimlerinin Belirlenmesi

Abstract

Aşırı tuz içeren ortamlar birçok canlı için yaşamın mümkün olmadığı habitatlardır. Bu nedenle, ekstrem halofilik canlıların tuza direnç mekanizmasının anlaşılması, diğer canlıların bu ortamlara adapte edilebilmesi için önem taşır. Bu çalışmada, Çankırı ve Yozgat'ta bulunan tuz madenleri ile Tuz Gölü'nden alınan tuz örneklerinden halofilik mikroorganizmalar izole edilip, izolatların kültürel, fenotipik ve biyokimyasal özellikleri belirlenmiş ve devamında 16S rRNA geni dizilerine göre cins seviyesinde tanımlamaları yapılmıştır. Tuza direnç mekanizmasının anlaşılması için, izolatlar içerisinden ekstrem halofilik arke Halolamina sp. YKT1'in düşük (2.7 M) ve yüksek (5.5 M) NaCl varlığında gen ifadelerinde meydana gelen değişmeler yeni nesil HiSeq 2000 dizileme teknolojisi kullanılarak incelenmiştir. 4.76 milyar nükleotit okumanın birleştirilmesi ile 3.918 protein kodlayan dizi ortaya çıkarılmıştır. Halolamina sp. YKT1'de 5.5 M NaCl içeren ortamda 2.7 M NaCl içeren ortama göre 2.149 genin ifadesinde artış, 1.638 genin ifadesinde ise azalma olduğu tespit edilmiştir. Bu genlerden ifadelerinde en çok değişme görülen 13 tanesi seçilerek biyoinformatik veriler qRT-PCR ile doğrulanmıştır. RNA dizileme sonuçları; hücre zarı ve madde taşınımıyla ilgili genlerin ifadesinin arttığını, protein metabolizmasıyla ilgili genlerin ifadesinde ise azalma olduğunu göstermiştir. Ayrıca, diğer bir ekstrem halofilik arke izolatı olan Haloarcula sp. TG1'in ürettiği proteaz enzimi üzerine sıcaklık, pH, tuz ve inhibitörlerin etkisi belirlenerek enzim karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. TG1 izolatına ait proteaz enziminin optimum pH 4.0'te 50ºC'de ve 4 M NaCl varlığında aktivite gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca, pH 3.0-10.0 arasında ve 25-90ºC'de 1 saat inkübasyon sonrasında bile aktivitesinin %90'ından fazlasını koruduğu gözlenmiştir. Enzim inhibitörlerinin etkisinin araştırıldığı deneyde, enzim aktivitesi üzerinde en fazla inhibisyonu (yaklaşık %25) DMSO ve etanolün gösterdiği, en düşük inhibitör etkiyi ise bir deterjan olan SDS'nin oluşturduğu belirlenmiştir. Bu çalışma ile halofilik mikroorganizmalarda tuza direncinin moleküler mekanizmaları RNA dizileme yöntemi ile belirlenmiş, aynı zamanda endüstriyel açıdan önemli bir enzim olan ve halofilik bir arke tarafından üretilen proteazın karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Haloarcula sp., halofil, Halolamina sp., proteaz, RNA dizileme, transkriptomExcess saline environments are not favorable habitats for most of the organisms. Therefore, the insight into the salt resistance mechanism of the extreme halophiles is important to adapt the other organisms to these environments. In the present study, halophilic microorganisms were isolated using the samples from salt mines in Çankırı and Yozgat as well as Tuz Gölü. The cultural, phenotypic, and biochemical properties of the isolates were determined, and their genera were identified according to 16S rRNA gene sequences. To understand the salt resistance mechanism, the changing transcripts of an extreme halophilic archeon, Halolamina sp. YKT1 isolate, upon growth in low (2.7 M) and high (5.5 M) NaCl concentrations were investigated via HiSeq 2000 next-gen sequencing technology. A 3.918 coding sequences were obtained after assembly of 4.76 billion nucleotide reads. Expression of 2.149 genes was induced and that of 1.638 genes was reduced in Halolamina sp YKT1 when grown in 5.5 M NaCl containing medium as compared to 2.7 M NaCl containing medium. Thirteen of these genes were verified by qRT-PCR. Expression of the genes related with cell membrane and transport was increased, and that of the genes related with protein metabolism was decreased. Besides, the protease enzyme produced by another extreme halophilic archeon, Haloarcula sp. TG1, was characterized by identifying the effects of temperature, pH, salt, and inhibitors on the enzyme activity. The protease from TG1 isolate showed optimum activity at pH 4.0, 50oC, and 4 M NaCl presence. Moreover, it kept more than 90% of its activity after 1h incubation between pH 3.0-10.0 and 25-90oC. As to the enzyme inhibitors, the highest inhibition (ca. 25%) was occurred by DMSO and ethanol while the lowest inhibition was generated by SDS, a detergent. In this study, molecular mechanisms underlying salt tolerance in halophilic microorganisms were determined by RNA seq. At the same time, characterization of industrially important protease enzyme produced by extreme halopilic archaeon was carried out. Key Words: Haloarcula sp., halophile, Halolamina sp, protease, RNA seq, transcriptome