Sığır İmmun Serumlarında Total Igg ve Yenidoğan Buzağı İshallerinde Anti-F5 (K99) Antikor Tespitine Yönelik In-House Elisa Prototipleri Geliştirilmesi ve Validasyon Çalışmaları

Abstract

Hem anti-F5 (K99) antikoru hem de sığır IgG tespiti için sırasıyla in house iELISA ve sandviç ELISA prototipleri geliştirilmiştir. Reaktif antijen olarak fimbrial K99 (fanC) rekombinant proteini kullanıldı ve K99 antikor tespiti için kalibre edildi. Optimal FanC konsantrasyonu SPSS 17.0 ile kalibrasyon eğrisi tahmininden 500 ng/ml olarak belirlendi. Optimal monoklonal antikor konsantrasyonu ve test serum dilüsyonu sırasıyla >0.5ug/ml ve 1:100 olarak belirlendi. Prototip, fanC antijeninin reaktivitesini değerlendirmek için iyi bilinen aşı serumlari ile değerlendirilmiştir. Tukey testi ile ilk aşılanan grup ile ikinci aşılanan grup arasında fark belirlendi ve ilk aşılanan grubun ikinci defa aşılanan gruptan daha iyi olduğu istatistiksel olarak gösterildi (p<0.05). Sığır IgG tespitine yönelik sandviç ELISA optimizasyonunda, 3 bloking solüsyon, bloking içermeyen PBS solüsyonu ile test edildi. Antijen, balık jelatini, yağsız süt ve sığır serum albümini dahil tüm bloke edici ajanlara reaktif bulunduğundan test bloking yerine PBS ile gerçekleştirildi. Doğrusallığı değerlendirmek için optimizasyon süreci boyunca bir kalibratör kullanıldı. Sandviç ELISA'nın analitik duyarlılığı 150-800 ng/ml olarak belirlendi. Kesinlik, %10'luk bir varyasyon ile belirlendi. Ancak referans örnekler ve iyi tanımlanmış serumlar ile doğrulama yapılmadı. Bu nedenle, bu çalışmada optimize edilen prototipler, saha ve referans örneklerle değerlendirilmelidir. Sandviç ELISA optimizasyonu başarıyla tamamlanırken, yeterli referans numunenin bulunmaması nedeniyle doğrulaması yapılamamıştır. Testlerin tanısal özellikleri henüz tamamlanmamış olsa da, prototipleryeni doğan buzağı ishali ve pasif transfer yetmezliği olan olgularda veya deneysel veriler ile değerlendirilebilir. Anahtar Sözcükler: Sığır IgG, ELISA, Pasif transfer yetmezliği (FPT), fanC, Yenidoğan buzağı ishaliFor the detection of anti-F5 (K99) antibodies and bovine IgG, In-house ELISA ELISA prototypes known as iELISA and sandwich ELISA were developed respectively. Fimbrial K99 (fanC) recombinant protein was used and calibrated as the reactive antigen for K99 antibody detection. The optimal FanC concentration was determined as 500 ng/ml from the curve estimation by SPSS 17.0. And the monoclonal antibody concentration and test serum dilution were determined as >0.5ug/ml and 1:100, respectively. The prototype has been employed to assess the reactivity of fanC antigen with the reference vaccinated bovine sera. The difference has been observed between the first and boosted vaccinated groups with Tukey's test and boosted vaccinated group was better than the primary vaccinated ones and the difference was important (p<0.05). In sandwich ELISA optimization for bovine IgG detection, 3 blocking solutions and PBS with no blocking solution of PBS were tested. Of all the blocking reagents including fish gelatine, skimmed milk, and bovine serum albumin were found reactive. A calibrator was used throughout the optimization process to asses the linearity. Analytic sensitivity of sandwich ELISA was 150-800 ng/ml. Precision was within the range with a 10% coefficient variation. However, test validation with the samples and reference sera was not evaluated. Therefore, the prototype optimized in this study should be evaluated in field and reference samples. While the sandwich ELISA optimization has been succesfully completed, the validation was not confirmed due to the non-availability of sufficient reference samples. Although the diagnostic properties of the tests have not been completed the prototypes can now be evaluated in cases with neonatal calf diarrhea and passive transfer failure, or with experimental data. Keywords: Bovine IgG, ELISA, Failure of passive transfer (FPT), fanC, Neonatal calf diarrhea