Köpek Spermasının Kriyoprezervasyonunda Mezenkimal Kök Hücre ve Seminal Plazma Kaynaklı Eksozomların Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Abstract

Bu çalışmada, köpek spermasının kriyoprezervasyonunda adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücre eksozomlarının (MSC-exo) ve farklı oranlardaki seminal plazma eksozomlarının (SP-exo etkileri incelendi. Çalışma, farklı zamanlarda 6 köpekten alınan 3'er ejakülatın Tris bazlı sulandırıcılar ile hazırlanması ve dört farklı grup oluşturularak (Kontrol, MSC-exo, %1,5 SP-exo, %2 SP-exo) spermanın dondurulması ile gerçekleştirilmiştir. Dondurma-çözdürme işlemi sonrası toplam spermatozoa motilitesi, progresif motilite, kinematik parametreler, canlılık, plazma membran bütünlüğü, kromatin hasarı, morfolojik bütünlük ve ROMO1, BAX, BCL2, PRM2 gen ekspresyon seviyeleri değerlendirildi. Bulgulara göre MSC-exo grubunun toplam motilite (%60,31±6,12) ve progresif motilite oranları (%22,09±3,34) diğer gruplara kıyasla anlamlı derecede yüksek bulunmuştur (P<0,05). Ayrıca MSC-exo grubunda plazma membran bütünlüğü (%66,94±2,24) ve canlılığı (%70,88±1,95) en yüksek değerlerde ölçülmüştür (P<0,05). MSC-exo, kromatin ve morfolojik bütünlüğü korumada etkili bulunmuş; chromomycin A3 (CMA3) boyama sonuçlarına göre normal kromatin paketleme oranı en yüksek (%91,33±0,61) bu grupta gözlenmiştir (P<0,05). Akrozom bütünlüğü özellikle MSC-exo grubunda tespit edilmiştir. SP eksozomları (%1,5 ve %2) ile hazırlanan gruplarda, kontrol grubuna kıyasla kısmi iyileşmeler saptanmakla birlikte bu iyileşmeler MSC-exo grubundaki kadar belirgin olmamıştır (P>0,05). Gen ekspresyon seviyelerinde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmamıştır (P>0,05). Ancak, MSC-exo grubunun gen seviyelerinde belirgin bir iyileşme eğilimi gözlenmiştir. Sonuç olarak, MSC-exo uygulamasının köpek spermasında kriyoprezervasyon kaynaklı hasarları önemli ölçüde azalttığı ve spermatolojik parametrelerde genel bir koruma sağladığı ortaya konulmuştur. Bu bulgular, MSC-exo'nun köpek sperması dondurma protokollerinde potansiyel bir biyolojik katkı maddesi olarak kullanılabileceğini göstermektedir.The effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell exosomes (MSC-exo) and different concentrations of seminal plasma exosomes (SP-exo) on the cryopreservation of canine sperm were investigated in this study. Ejaculates were collected from six dogs at different times, with three ejaculates per dog. The samples were prepared using Tris-based extenders and divided into four groups: Control, MSC-exo, 1.5% SP-exo, and 2% SP-exo, followed by sperm freezing. Post-thaw evaluations included total sperm motility, progressive motility, kinematic parameters, viability, plasma membrane integrity, chromatin damage, morphological integrity, and the expression levels of ROMO1, BAX, BCL2, and PRM2 genes. The results showed that the MSC-exo group had significantly higher total motility (60.31 ± 6.12%) and progressive motility (22.09 ± 3.34%) compared to the other groups (P < 0.05). Additionally, plasma membrane integrity (66.94 ± 2.24%) and viability (70.88 ± 1.95%) were also highest in the MSC-exo group (P < 0.05). The MSC-exo group was particularly effective in maintaining chromatin and morphological integrity. Chromomycin A3 (CMA3) staining revealed that the highest rate of normal chromatin packaging (91.33 ± 0.61%) was observed in this group (P < 0.05). Furthermore, acrosome integrity was most prominent in the MSC-exo group. While groups treated with SP exosomes (1.5% and 2%) showed partial improvements compared to the control group, these enhancements were less pronounced than those in the MSC-exo group (P > 0.05). No statistically significant differences in gene expression levels were observed among the groups (P > 0.05). However, a trend toward improved gene expression levels was noted in the MSC-exo group. In conclusion, the application of MSC-exo significantly reduced cryopreservation-induced damage in canine sperm and provided overall protection of sperm parameters. These findings suggest that MSC-exo could be a promising biological additive in canine sperm cryopreservation protocols.