Bacillus Mojavensis Th309 Türüne Ait Pektat Liyazın (Bmopela) Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Abstract

Enzimlerin endüstriyel üretim süreçlerinde kullanımını sınırlayan en önemli etmenlerden bir tanesi uygulama sırasında maruz kaldıkları sert çevresel koşullarda ve ortamdaki substrat harici bileşikler karşısında kararlılıklarını koruyamamalarıdır. Geniş sıcaklık ve pH aralıklarında gelişim gösterebilen halotolerant Bacillus mojavensis TH309'dan elde edilecek enzimlerin bu ihtiyacı karşılama potansiyeli oldukça yüksektir. Bundan dolayı, sunulan tez kapsamında pektinin β-eliminasyon reaksiyonları sonucunda parçalanmasında rol oynadığı için tekstil, gıda ve içecek endüstrilerinde sıkça kullanılan pektat liyaz enzimini kodlayan pel geni B. mojavensis TH309 genomundan pET-14b'ye aktarılmış ve histidin etiketi ile birlikte E. coli BL21 (DE3)'de heterolog olarak ifade edilmiştir. Ayrıca, pektat liyazın (BmoPelA) saflaştırılması ve karakterizasyonu gerçekleştirildikten sonra tekstil endüstrisinde kullanım potansiyeli değerlendirilmiştir. BmoPelA'nın en yüksek katalitik aktiviteyi 90 oC'de sergilediği ve bu sıcaklıkta 120 dk'lık ön-inkübasyon sonrasında dahi aktivitesinin %80'den fazlasını koruduğu belirlenmiştir. BmoPelA'nın alkali koşullarda (pH 8-13) kararlı olmasının yanı sıra en yüksek aktiviteyi pH 11'de gösterdiği tespit edilmiştir. Metal iyonları (1 mM) arasından Zn+2'nın BmoPelA aktivitesini %8 arttırdığı, K+'nın ise aktiviteyi %55 oranında azalttığı gözlemlenmiştir. Diğer metallerin (Ca+2, Mg+2, Mn+2 ve Ba+2) varlığında ise BmoPelA aktivitesinde yalnızca %18-35'lik bir azalma kaydedilmiştir. BmoPelA'nın metal iyonları ile 60 dk'lık ön-inkübasyonu sonrasında ise görece aktivitesi en düşük %65 olarak hesaplanmıştır. Reaksiyon karışımında kloroform (%10 ve %30) ve izopropanol (%30) varlığının BmoPelA aktivitesini düzenlediği tespit edilmiştir. BmoPelA'nın, son derşimleri %10 olacak şekilde etanol, aseton, metanol, DMSO ve bütanol ile 60 dk'lık ön-inkübasyonunun aktiviteyi düzenlediği ancak %30'luk etanol, aseton ve metanol ile ön-inkübasyonun ise aktivitede önemli oranda düşüşe neden olduğu tespit edilmiştir. PMSF, DTT, tween 20, triton X-100, SDS ve EDTA gibi kimyasalların BmoPelA aktivitesi ve kararlılığını önemli ölçüde azalttığı belirlenmiştir. Son olarak, BmoPelA'nın ham pamukta lif boyanabilirliğini arttırdığı tespit edilmiştir. B. mojavensis TH309 pel geninin klonlanmasına, ifade ettirilmesine ve genin ürünü olan pektat liyazın (BmoPelA) karakterizasyonuna dair bilgimiz dahilinde daha önce yapılmış herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. Bu nedenle, BmoPelA'nın pamuk endüstrisinde kullanım potansiyeli bu çalışma ile ortaya konmuştur.One of the most important factors limiting the use of enzymes in industrial production processes is their inability to maintain their stability in the harsh environmental conditions they are exposed to during application and against non-substrate compounds in the environment. Therefore, the need for stable enzymes is increasing day by day, even under harsh industrial conditions. The enzymes to be obtained from the halotolerant B. mojavensis TH309, which can grow in wide temperature and pH ranges, have a very high potential to meet this need. Therefore, within the scope of the presented thesis, the pel gene encoding the pectate lyase (BmoPelA) enzyme, which is frequently used in the textile, food and beverage industries, was transferred from the B. mojavensis TH309 genome to pET-14b, and together with the histidine tag, expressed heterologously in E. coli BL21 (DE3) strain because it plays a role in the degradation of pectin as a result of β-elimination reactions. In addition, after the purification and characterization of the BmoPelA, its potential for use in the textile industry was evaluated. It was determined that the pectate lyase (BmoPelA) exhibited the highest catalytic activity at 90 oC and preserved more than 80% of its activity even after 120 min of pre-incubation at this temperature. Besides being stable in alkaline conditions (pH 8-13), it was determined that the BmoPelA showed the highest activity at pH 11. Among metal ions (1 mM), it was observed that Zn+2 increased the BmoPelA activity by 8%, while K+ decreased the activity by 55%. In the presence of other metals (Ca+2, Mg+2, Mn+2 and Ba+2), only an 18-35% decrease was observed in BmoPelA activity. After 60 minutes of pre-incubation of the BmoPelA with metal ions, the relative BmoPelA activity was calculated as the lowest 65%. It was determined that the presence of chloroform (10% and 30%) and izopropanol (30%) in the reaction mixture regulated the BmoPelA activity. It was determined that pre-incubation of the BmoPelA with 10% ethanol, acetone, methanol, DMSO and butanol for 60 min regulated the activity, but pre-incubation with 30% ethanol, acethone and methanol caused a significant decrease in the activity. It has been determined that chemicals such as PMSF, DTT, tween 20, triton X-100, SDS and EDTA significantly reduce BmoPelA activity and stability. Finally, the BmoPelA was found to increase fiber dyeability in raw cotton. To the best of our knowledge, no work has been done on the cloning and expression of the B. mojavensis TH309 pel gene and the characterization of its product, pectate lyase (BmoPelA). Therefore, BmoPelA's potential for use in the cotton industry has been demonstrated by this study.