E.coli'de Tam Boyutlu ve Kesilmiş Yeni Ccdc-124 Proteinin Klonlaması, Ekspresyonu ve Biyokimyasal Özellikleri

Abstract

Proteinlerde yapısal bir mofif olan sarmal-bobin domeyini içeren-124 (CCDC-124: Coiled-coil domain containing 124) motifi, düşük organizasyonlulardan yüksek organizasyonlulara kadar uzanan geniş bir spektrumdaki ökaryotlarda korunmuş bir proteindir. CCDC-124 sitokinetik rolü ile uyumlu olarak sentrozom ve orta cisimcikte lokalize olmasına rağmen, nüklear ve sitoplazmik kompleksler arasında bir mekik gibi görünmektedir. CCDC-124 en az bir olası RNA-bağlama bölgesi içermektedir. Daha önceki kütle spektrometrisine dayanan proteomik çalışmalarımıza göre CCDC-124'ün nüklear ve sitoplazmik faz ayırımı kompleksleri ile ilişkili olduğu görülmektedir. Bugüne kadar proteinin işlevini ve özelliklerini tanımlamak için birçok çalışma yapılmıştır. Bu çalışmada ise CCDC-124 proteininin çeşitli parçalarının proteinin biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri üzerindeki işlevsel rolünün araştırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla CCDC-124 proteininin güdükleştirilmiş (kesilmiş) dört mutantı hazırlanmıştır: 32 kDa izoformu için C-ucu olmayan bir mutant ve N-ucu olmayan ikinci bir mutant yapılmış, kalan iki mutant ise olası RNA-bağlama bölgesine göre tasarlanmıştır. CCDC-124 proteininin parçalarının fizikokimyasal özelliklerini belirlemek için tam uzunluktaki ve güdük proteinlerin ifadeleri E. coli hücrelerinde gerçekleştirilmiş ve saflaştırılmıştır. Daha sonra saflaştırılmış proteinler çeşitli kimyasal maddelere maruz bırakılmış ve böylece proteinlerin faz ayırımı davranışına sahip olup olmadığı incelenmiştir. Elde edilen veriler ile CCDC-124 proteininin fizyolojik çalışması hakkında faydalı bilgiler elde edilmiştir.Coiled-coil domain-containing 124 (CCDC-124) protein is an eukaryotic protein that is conserved with a spectrum extends low to high eukaryotes. Despite CCDC-124 mainly localizes centrosome and midbody with a correlation its cytokinetic role, it also seems to be as a shuttle between nuclear and cytoplasmic complexes. CCDC-124 contains at least one putative RNA-binding domain. According to our previous studies of mass spectrometry-based proteomics and their validations CCDC-124 appears to be related to nuclear and cytoplasmic phase-separated complexes. To date many studies have been done to identify the function and properties of the CCDC-124 protein. In this study, we aimed to investigate the functional role of CCDC-124 protein fragments on biochemical and biophysical properties. We have prepared four truncated mutants: one without a C-terminus and one without N-terminus required for the 32 kDa isoform, the other two mutants are designed according to the putative RNA-binding region. To determine the physicochemical properties of full length and truncated fragments of CCDC-124 protein, we expressed and purified the protein form E. coli cells. Then purified proteins subjected to various chemical agents. Thus we could try to understand if the proteins have phase separation behavior. Our results provide useful information about the physiological role of the protein.