CRISPR-Cas9 Sistemini İfade Eden Transgenik Tütün Bitkisinin Elde Edilmesi

Abstract

ZFN, TALEN ve CRISPR yöntemleri DNA'da hedeflenen bölgeye bağlanabilmeleri sayesinde genom düzenlenmesinde sık kullanılan tekniklerdir. Hedeflenmiş nükleazların kullanımı sayesinde hedef genler mutasyona uğratılarak ya da genomdan çıkartılarak susturulabilmekte ya da genlerde hedeflenen nükleotidlerin değiştirilmesi mümkün olabilmektedir. Son yıllarda yeni nesil genom düzenleme aracı olarak düzenli aralıklarla bölünmüş palindromik tekrar kümeleri ile (CRISPRs)-ilişkili Cas9 nükleazları kullanılmıştır ve elde edilen sonuçlar bitki biyoteknolojisinde devrim yaratıcı nitelikte olmuştur. CRISPR-Cas9, çok yönlülüğü, düşük maliyeti ve yüksek verimliliği nedeniyle tercih edilerek genom düzenleme aracı olarak hızla benimsenmiştir ve yaygın şekilde kullanılmaktadır. Daha etkili genom düzenleme için CRISPR teknolojisinin optimizasyonuna yönelik çalışmalar yapılmakta olup, CRISPR sistemi kullanılarak yapılan genom mühendisliği çalışmalarına her gün yenileri ilave edilmektedir. Böylece bu tekniğin daha yaygın kullanılmasıyla mevcut çalışmalar bir adım daha ileriye taşınmış olacaktır. Bu tez çalışmasında tütün bitkisinde CRISPR-Cas9 sisteminin ilk basamağı olan Cas9 proteinlerinin ifade ettirilmesi hedeflenmiştir. Cas9 geni Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla tütün bitkisine aktarılmıştır ve elde edilen aday transgenik bitkilerden rastgele seçilen tütün hatlarından PCR analizi ve higromisin analizi yapılmıştır.

ZFN, TALEN, and CRISPRs are techniques frequently used in genomic regulation due to their ability to bind to target regions in DNA. The target genes can be silenced by mutation, genomic deletion, to possibly replace the targeted nucleotides in the genes using targeted nucleases. In recent years, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs) – was used with Cas9 nucleases as a new generation genome editing tool, and the results have been revolutionary in plant biotechnology. CRISPR / Cas9 is rapidly adopted and widely used as the preferred genomic editing tool due to its versatility, design simplicity, low cost and high efficiency. The ease of designing the guide RNA targeting Cas9 to the desired DNA locus and the high specificity and efficiency of CRISPR-Cas9-mediated DNA breaks make the CRISPR-Cas9 genome editing tool extremely useful. Studies are being conducted to optimize CRISPR technology for more effective genomic regulation, and genomic engineering studies using the CRISPR system. Thus, the use of this technique, moves current work one step further and will allow the development of better quality yield and tolerant varieties of environmental factors. In this thesis, transfer of Cas9 gene into tobacco plant was optimized using Agrobacterium tumefaciens. PCR analysis and hygromycin analysis was performed on randomly selected tobacco lines from the candidate transgenic plants obtained.