Aspirinin Vasküler Endotel Hücre Kültüründe Oksidatif ve Nitrozatif Stres Üzerine Etkilerinin Araştırılması

Abstract

Aspirinin bilinen pıhtı önleyici etkilerine ek olarak vasküler endotelyumun korunmasını sağladığı gösterilmiştir. Aspirinin endotel fonksiyonlarında düzeltme sağladığını gösteren klinik verilerin, hücre düzeyinde hangi mekanizmalarca sağlandığını göstermek amacıyla çalışmamızı planladık. Bu çalışmada, endotel hücrelerine farklı dozlarda aspirin verilerek, CAT, SOD, GSH-Px, lipid peroksidaz ve NO aktivitesinde zamanla değişikliğe yol açıp açmadığının, farklı dozlar arasında farklılık olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır.Çalışmada kullanılan 24 kuyucuklu mikroplatelerdeki endotel hücrelerinden (HUVEC) her sıradaki 4 kuyucuktan 2'sine 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 ve 1500 µM dozlarında aspirin verilirken, diğer 2 kuyucuk kontrol olarak alındı. Buna göre hücre lizatlarından bazal şartlarda (0. saat), 24. saatte, 48. saatte ve 72. saatte katalaz, süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz ve lipid peroksidasyonu ölçümleri yapılırken hücre medyumlarından ise NO salınımına bakıldı. MTT ölçümü için, 96 kuyucuklu mikroplate'lerdeki hücrelere 3 kontrollü 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 ve 1500 µM dozlarında aspirin verilirken 3 kuyucuk kontrol kuyucuğu olarak kullanıldı. 0, 24, 48 ve 72. saatlerdeki absorbans ölçümleri yapıldı.MTT analizlerine göre, kontrol grubuna göre %50 absorbans azalması ile belirlenen toksik doz düzeyi 0, 24 ve 72. saatte ölçülen analizlerde 1500 ?M olarak belirlenirken, 48. saatteki ölçümlerde 1000 ?M olarak saptanmıştır. Farklı ilaç dozları verilen ve kontrol olarak belirlenen hücrelerden elde edilen lizatlardan bazal şartlarda (0. saat) ölçülen CAT, SOD, GSH-Px ve lipid peroksidaz değerleri arasında anlamlı farklılık saptanmamıştır (p>0.05). Yine 24. Saat (p=0.696), 48. Saat ve 72. saatte ölçülen CAT, SOD, GSH-Px ve lipid peroksidaz değerleri farklı ilaç dozları ve kontrol arasında farklılık göstermemiştir (p>0.05). 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 ve 1500 µM ilaç verilen hücrelerden elde edilen lizatların her birinden 0., 24., 48. ve 72. saatte ölçülen CAT, SOD, GSH-Px ve lipid peroksidaz değerleri karşılaştırıldığında, zamana göre farklılık göstermediği saptanmıştır (p>0.05). Aspirin verilmeyen kontrol grubunda ise 0., 24., 48. ve 72. saatte ölçülen CAT, SOD ve GSH-Px değerleri arasında anlamlı fark saptanırken (sırasıyla p < 0,0001, p < 0,003 ve p < 0,02) lipid peroksidaz aktivitesinde değişiklik olmamıştır. 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 ve 1500 µM ilaç verilen ve kontrol olarak belirlenen hücrelerin medyumları kullanılarak yapılan analizlerde bazal şartlarda (0. saat), 24., 48. ve 72. saatte ölçülen nitrik oksit değerleri arasında anlamlı farklılık saptanmamıştır (p>0.05).Aspirin verilmeyen hücrelerde zamanla hücre sayısının fazlalaşmasından dolayı ortamdaki serbest radikal oluşumunun artmasından kaynaklı antioksidan enzim aktivitesinde artış görülmüştür. Aspirin verilmesi zamanla artan reaktif antioksidan enzim aktivitesindeki artışı engellemiştir. Ancak aspirin belli dozların üzerinde verildiğinde MTT ile belirlenen hücre sayısında azalmaya sebep olacak düzeyde toksik etki yapmıştır. Bu sonuç, toksik olamayan dozlarda aspirin verilmesinin hücre koruyucu etkisi olabileceğini düşündürmüştür.In addition to thrombus prevention effects, it was shown that Aspirin also provided protection of vascular endothelium. We planned our study to demonstrate the mechanisms at cellular level in order to explain clinical data showed that aspirin provided improvement of endothelial function. In this study, it was aimed to investigate that whether any change in activity of CAT, SOD, GSH-Px, lipid peroksidase and NO over time, and whether any difference between the different doses by giving different doses of aspirin to endothelial cells.Endothelial cells (HUVEC) in 24 wells microplates used in this study and 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 and 1500 µM Aspirin to 2 of 4 wells at each row were given, the other 2 wells were included as controls. Accordingly, while catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase levels and lipid peroxidation were being measured, NO release from cell media was observed. For the measurement of MTT, 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000 and 1500 µM Aspirin were given to cells in 96 wells microplates, 3 wells were used as control. Absorbance measurements were performed at 0, 24, 48 and 72 hours.According to MTT analysis, toxic dose level that defined as 50% decrease in absorbance compared to control group were determined as 1500 µM at 0, 24 and 72 hours analysis and 1000 µM at 48 hours analysis. The significant differences were not found between the baseline (0 hour) CAT, SOD, GSH-Px and lipid peroxidase levels measured from lisates that obtained from the cells that different drug doses given and controls (P>0,05). Also, CAT, SOD, GSH-Px and lipid peroxidase levels at 24 (p=0.696), 48 and 72 hours did not show any difference between different drug doses and control (p>0.05). When the CAT, SOD, GSH-Px and lipid peroxidase levels at 0, 24, 48, and 72 hours measured from each lisates obtained from cells that 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, and 1500 µM drugs given compared, there were no differences between them according to time (p>0.05). In the control group that Aspirin was not given, significant differences were found between CAT, SOD and GSH-Px levels measured at 0, 24, 48, 72 hours (p<0.0001, p<0.003 and p<0.02 respectively) but lipid peroxidase activity showed no difference. In the analysis that performed by using the cell media that defined as control and 25, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, and 1500 µM drugs given, no significant difference was found between the nitric oxide levels at baseline (0 hour), 24, 48 and 72 hours (p>0.05).Increase in antioxidant enzyme activity in the cells that Aspirin were not given, caused by raised free radical formation due to increase in number of cells by time was observed. Aspirin prevented the increase in reactive enzyme activity which increases by time. However, aspirin when given above the proper doses caused toxic effect that resulted decrease in cell number that determined by MTT. This result made us to think that possibility of nontoxic doses of Aspirin might protect the cells.