Farklı Sıcaklıklarda İn Vitro Olgunlaştırılan Sığır Oositlerinde Isı Şok Proteini 70'in Belirlenmesi

Abstract

Bu çalışma, sığır oositlerinin in vitro olgunlaştırılmasında (IVM) uygulanan 36,5 °C ve 38,5 °C kültür sıcaklıklarının ısı şok protein 70 üzerine etkisini belirlemek amacıyla yapılmıştır. Çalışmada sığır kumulus oosit kompleksleri (KOK), % 10 fetal calf serum eklenmiş bikarbonat tamponlu medyum-199'da 36,5 °C veya 38,5°C de ve % 5 CO2 içeren içeren nemlendirilmiş ortamda 24 saat IVM'na bırakılmıştır. IVM sonunda KOK'lerinin olgunlaşmaları tam kumulus genişlemesine göre belirlenmiştir. Olgunlaşan KOK'ların kumulus hücreleri % 0,1 hyrulinidaz enzimi içeren hepes tamponlu TCM-199'da 10 dakika vortekslenerek uzaklaştırıldıktan sonra % 9,6'lık fosfat tamponlu tuz çözeltisinde (PBS) yıkanıp protein izolasyonuna geçilmiştir. Protein örneklerinin konsantrasyonunu arttırmak için örnekler 24 saat -80 °C'de dondurulduktan sonra liyofilizatörde 0.140 hPA basınç altında lyofilize edilip –20 °C'de depolanmıştır. Oositlerin 70 kDa ağırlıktaki proteinlerin seviyesi SDS- PAGE yöntemi ile belirlenmiştir. IVM'de uygulanan 36,5 °C (% 81,11) veya 38,5°C (% 84,41) inkübasyon sıcaklıkları arasında kumulus genişlemesi bakımından bir farklılık tespit edilmemiştir. Western blot sonucunda farklı sıcaklıklarda olgunlaştırılan sığır oositlerinin ısı şok 70 proteini bant görüntüsü elde edilemediğinden dolayı farklı inkübasyon sıcaklıklarının sığır oositlerinin ısı şok proteinin 70 üzerine olabilecek etkileri tespit edilememiştir. Anahtar kelimeler: Oosit Olgunlaştırma, Kültür Sıcaklığı, Isı Şok Proteini 70, Western Blot

This study was conducted to determine the effect of 36,5 or 38,5 °C culture temperatures during vitro maturation (IVM) on heat shock protein 70 in cattle oocytes. In the study, bovine cumulus oocyte complexes (COC) were subjected to IVM in bicarbonate-buffered TCM–199 supplemented with 10% FCS for 22 hours with a humidified 5% CO2 in air at either 36,5 or 38,5 °C. Maturation of COCs was determined according to fully cumulus expansion at the end of in vitro maturation period. The cumulus cells of matured COCs were removed by vortexing in TCM-199 with hepes buffered TCM-199 containing 0,1% hyaluronidase enzyme, following washing in 9,6 % phosphate buffered saline solution for protein isolation. To increase the concentration of isolated protein samples, the samples were frozen at -80 °C for 24 hours and lyophilized at 0,140 hPa in lyophilizer, and stored at -20 °C. The level of 70 kDa proteins in oocytes was determined by SDS-PAGE method. There were no significant differences between 36,5 ° C (81,11%) or 38,5 ° C (84,41%) incubation temperatures in IVM in terms of full cumulus expansion. Since the heat shock 70 protein band image of bovine oocytes maturated at different temperatures could not be obtained after Western blot analysis, the effects of different incubation temperatures on bovine oocytes of heat shock protein 70 could not be determined. June 2018, 83 Key Words: Oocyte Maturation, Culture Temprature. Heat Shock Protein 70, Western Blott