Streptomyces Clavuligerus'ta Demir Regülasyonu ve Sekonder Metabolit Üretimi Arasındaki İlişkinin Belirlenmesi

Abstract

Demir dünyada en bol bulunan elementlerden biridir ve mikroorganizmalar gelişimleri için bu elemente ihtiyaç duyarlar. Demir elementinin; fotosentez, trikarboksilik asit (TCA) döngüsü, gen regülasyonu, azot fiksasyonu, ATP sentezi ve DNA sentezi gibi birçok metabolik reaksiyonlarda düzenleyici görevi vardır. Bakteriler demir ihtiyaçlarını karşılayabilmek için sideroforları kullanırlar. Patojenler ve antibiyotik üreticisi bakterilerin siderofor ürettikleri bilinmektedir. Dünyada mevcut antibiyotiklerin üçte ikisini üreten ve 25 milyar dolarlık piyasa hacmine sahip Streptomyces sp.'ler sekonder metabolitlerin üretiminde önemli bir role sahiptir. Birçok Streptomyces türünde siderofor biyosentezinde, sideroforların hücre dışına salınımı ve demir-siderofor komplekslerinin hücre içine alınımından sorumlu genler ve gen kümeleri belirlenmiş ve ayrıca demir metabolizması ve antibiyotik üretimi/morfogenez arasındaki bağlantıyı gösteren birçok çalışma yapılmıştır. Ancak, bir β-laktam antibiyotiği olan sefamisin C, tunikamisin-türevi antibiyotiklerle klavulanik asit gibi önemli bir ilaç hammaddesini üretebilen Streptomyces clavuligerus'un siderofor gen kümesi ve demir regülasyonunun, ürettiği sekonder metabolitlerle olan ilişkisi henüz açıklanmamıştır. Bu kapsamda, S. clavuligerus'ta Fur ailesine benzer demir alımı regülatör proteinini kodlayan SCLAV_3199 geni REDIRECT yöntemi ile genomdan silinmiştir. Mutant bakteri ile yabanıl suş demir içeren ve içermeyen CDM besiyerinde üretilerek elde edilen RNA'lardan RNA transkriptom analizi gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, S. clavuligerus tarafından sentezlenen siderofor, sefamisin C, klavulanik asit ve tunikamisin türevi sekonder metabolit üretimleri biyoassay deneyleri ile mutant bakteriye kıyasla karşılaştırmalı olarak ncelenmiştir. Transkriptom dizileme sonucu SCLAV_3199 geninin birçok transkripsiyonel regülatör ve taşıyıcılar üzerinde düzenleyici bir etkisi olduğu tespit edilmiştir. Ortamda demirin bulunmadığı durumda siderofor ile ilişkili genlerin kontrole kıyasla mutant suşta daha fazla ifade olduğu belirlenmiştir. Demir içeren CDM besiyerinde S. clavuligerus Δ3199'da antibiyotik üretimi desteklenmezken, nişasta-asparajin besiyerinde (SA) fermantasyon sonucu mutant suşta kontrole kıyasla daha iyi sefamisin C ve klavulanik asit üretimi gözlemlenmiştir. Bununla birlikte, S. clavuligerus Δ3199'un tunikamisin üretimi en iyi TSB kültürlerinden elde edilmiştir. Sonuçlarımız, SCLAV_3199 geninin S. clavuligerus'ta demir homeostazı ve sekonder metabolit üretimi üzerindeki düzenleyici etkisini ortaya koymuştur.Iron is one of the most abundant elements on earth and microorganisms need it for their growth. Iron element; It has a regulatory role in many metabolic reactions such as photosynthesis, TCA (tricarboxylic acid) cycle, gene regulation, nitrogen fixation, ATP synthesis and DNA synthesis. Bacteria use siderophores to meet their iron needs. Pathogens and antibiotic producing bacteria are known to produce siderophores. Streptomyces, which produces two-thirds of the antibiotics available in the world and has a market volume of 25 billion dollars, has an important role in the production of secondary metabolites. Genes and related clusters responsible for siderophore biosynthesis, extracellular release of siderophores and uptake of iron-siderophore complexes in many Streptomyces species have been identified, and many studies have been conducted showing the link between iron metabolism and antibiotic production/morphogenesis. However, the relationship with these secondary metabolites produced by the siderophore gene cluster and iron regulation of S. clavuligerus, which can produce an important drug raw material such as cefamycin C, a β-lactam antibiotic, tunicamycin-derived antibiotics and clavulanic acid, has not yet been explained. In Streptomyces clavuligerus, the SCLAV_3199 gene, which encodes an iron uptake regulator protein similar to the Fur family, was chosen as the target. The SCLAV_3199 gene was deleted by the REDIRECT method. RNA transcriptome analysis was performed from the obtained RNAs by growing mutant bacteria and wild strain in CDM medium with or without iron. In addition, the production of siderophore, cefamycin C, clavulanic acid and tunicamycin derivative secondary metabolites synthesized by S. clavuligerus were comparatively examined compared to mutant bacteria by bioassay experiments. As a result of transcriptome sequencing, it was determined that the SCLAV_3199 gene has a regulatory effect on many transcriptional regulators and transporters. In the absence of iron in the environment, siderophore-related genes were expressed more in the mutant strain compared to the control. While no results were obtained regarding antibiotic production in S. clavuligerus Δ3199 in iron-containing CDM medium, better cephamycin C and clavulanic acid production was observed in the mutant strain compared to the control as a result of fermentation in starch-asparagine medium (SA). In addition, tunicamycin production by S. clavuligerus Δ3199 was best achieved in TSB cultures. Our results revealed the regulatory effect of the SCLAV_3199 gene on iron homeostasis and secondary metabolite production in S. clavuligerus.