Psikrotolerant Pseudomonas Sivasensis R11s16 İzolatından Yqia Ycfp Geninin Moleküler Klonlanması, Heterolog İfadesi, Karakterizasyonu ve Antibiyotik Giderim Potansiyelinin Araştırılması

Abstract

Sunulan bu çalışma kapsamında; Kaçkar dağlarından izole edilerek 16S rRNA gen dizisi temelinde Pseudomonas sivasensis R11S16 olarak tasarlanan psikrotolerant bakteri suşundaki esteraz enzimi kodlama potansiyeli olan yqiA/ycfP genleri pET20b(+) vektörüne klonlanarak E.coli BL21(DE3)'te ifade edilmiştir. Enzim aktivitesi analizlerinde substrat olarak p-nitrofenil bütirat kullanılmıştır. Bir ünite (U) enzim aktivitesi, substrattan dakikada 1 µmol p-nitrofenol salınımına neden olan enzim miktarı olarak tanımlanmıştır. Toplam protein miktarı ise Bradford yöntemi ile tahmin edilmiştir. Buna göre, amfisilinli LB besiyerinde 100 mM IPTG varlığında rekombinant molekülü/vektörü barındıran E. coli klonunun 25 °C ve 150 rpm'de 12 saat inkübasyonu ile üretilen enzim miktarı 0,510 U/mL olarak tespit edilmiştir. Histidin etiketi yardımıyla saflaştırılan enzim kısmen karakterize edilmiştir. Enzimin en iyi aktivite gösterdiği sıcaklığın 20 °C, pH'nın ise 9 olduğu tespit edilmiştir. Reaksiyon karışımında %1 NaCl varlığının enzim aktivitesini arttırdığı tespit edilmiş olup, NaCl'nin %16'ya kadar arttırılması enzim aktivitesinde önemli bir düşüşe neden olmamıştır. Metal iyonları arasından; Ba2+, Ca2+, K+, Mg2+ ve Co+2'ın (1 ve 10 mM) enzim aktivitesini arttırdığı, Cu2+, Fe2+ ve Ni2+nin ise azalttığı belirlenmiştir. Sürfektanlar arasından; Tween 20 ve SDS'in 1 ve 10 mM, Triton X-100'ün ise 10 mM konsantrasyonda enzim aktivitesini azalttığı, öte yandan 1 mM Triton X-100'ün aktiviteyi düzenlediği gözlemlenmiştir. Ayrıca; reaksiyon karışımına son konsantrasyonları %10 ya da %30 olacak şekilde etanol, metanol, kloroform, aseton, izopropanol, DMSO ve bütanol ilavesinin enzim aktivitesinde önemli seviyede azalmaya neden olduğu belirlenmiştir.In this study, the yqiA/ycfP genes, which has the potential to code for the esterase enzyme in the psychrotolerant bacterial strain isolated from the Kaçkar Mountains and designed as Pseudomonas sivasensis R11S16 based on the 16S rRNA gene sequence, was cloned into the pET20b(+) vector and expressed in E. coli BL21(DE3). In enzyme activity analyses, p-nitrophenyl butyrate was used as the substrate. One unit (U) of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that causes the release of 1 µmol p-nitrophenol from the substrate per minute. The total protein amount was estimated by the Bradford method. Accordingly, the amount of enzyme produced by incubating the E. coli clone harboring the recombinant molecule in the presence of 100 mM IPTG in ampicillin-containing LB medium at 25 °C and 150 rpm for 12 hours was determined as 0.510 U/mL. The enzyme purified with the help of histidine tag was partially characterized. It was determined that the temperature at which the enzyme showed the best activity was 20 °C and pH 9. It was found that the presence of 1% NaCl in the reaction mixture increased the enzyme activity, and increasing NaCl up to 16% did not cause a significant decrease in the enzyme activity. Among the metal ions; it was determined that Ba2+, Ca2+, K+, Mg2+and Co2+ (1 and 10 mM) increased the enzyme activity, while Cu2+, Fe2+and Ni2+ decreased it. Among the surfactants; it was observed that Tween 20 and SDS at 1 and 10 mM, and Triton X-100 at 10 mM concentrations decreased the enzyme activity, while 1 mM Triton X-100 regulated the activity. In addition; it was determined that the addition of ethanol, methanol, chloroform, acetone, isopropanol, DMSO and butanol to the reaction mixture at final concentrations of 10% or 30% caused a significant decrease in enzyme activity.