CRISPR Cas9 Sistemi Kullanılarak Tütün Bitkisinde Agos7 Geninin Susturulması

Abstract

Tütün (Nicotiana tabacum L.), patlıcangiller (Solanaceae) familyasından tek yıllık bir bitki olup, keyif verici bitkiler kategorisine girmektedir. Ekonomik olarak oldukça önemli bir konuma sahip olan tütün bitkisi endüstriyel ve aromatik bitki olarak da sınıflandırılmaktadır. Coğrafi şartlardaki farklılıklara hızlı ve etkin bir şekilde uyum sağlayabilen tütün, uyum yeteneği en iyi olan tarım ürünlerinden birisi olarak bilinmektedir. Genom düzenleme teknolojilerinin kullanılmasıyla oluşan mutasyonların, doğal olarak oluşan genetik mutasyonlarla ve varyasyonlardan ayrılamadığı için, çeşitli sektörlerde kullanım alanları genişlemektedir. Bu yöntemler, tarımsal ürünün hastalık veya zararlılara karşı direncini bir bölgeye veya gene özgü mutasyonla arttırmak için kullanılabilmektedir. Ek olarak, gen fonksiyonlarının belirlenebilmesi için de kullanılabilmektedir. Sonuç olarak, ZFN, TALEN ve CRISPR/Cas9 gibi yeni nesil genom düzenleme teknolojileri, güçlü genom düzenleme araçları olarak ortaya çıkmaktadır. Yeniliği, düşük maliyeti ve geniş uygulanabilirliğinden dolayı, CRISPR/Cas9 son 5 yılda popüler bir genom düzenleme tekniği haline gelmiştir. Bitkiler için önemli olan genlerden birisi de Argonaute (AGO) gen ailesi proteinleridir. Argonaute gen ailesi birçok farklı türde bulunabilir ve RNA kaynaklı susturma kompleksinde çok önemli bir role sahiptir. Bu gen ailesinin proteinleri; bitki gelişimi, büyümesi, biyotik ve abiyotik streslere yanıtta rol oynayan PAZ ve PIWI olmak üzere iki farklı bölge içermektedir. Önceki çalışmalar, AGO genlerinin ifadesinin, kuraklık, tuzluluk, yüksek sıcaklık ve düşük sıcaklık gibi farklı abiyotik stres türleri altında önemli ölçüde değiştiğini göstermiştir. Ayrıca, AGO gen ailesinin bazı üyelerinin hücre büyümesi, programlı ölüm ve hücre iskeleti üzerinde bir işlevi olduğunu gösteren çalışmalar bulunmaktadır. Model bitkilerde biyoinformatik analiz ile bulunan sonuçların homolojisine dayanarak, tütün bitkisinde AGO7 geni (LOC107784577) seçilmiştir ve CRISPR/Cas9 tekniği ile susturulmuştur. Elde edilen veriler ışığında, AGO7 mutantlarının, yabani tip bitkilere kıyasla bitkilerin morfolojisi ve fizyolojisinde önemli ölçüde değişiklik gösterdiği gözlemlenmiştir.Tobacco (Nicootiana tabacum L.) is an annual plant of Solanaceae family and categorized in delightful plants. Economically important tobacco is also classified as an industrial and aromatic plant. Tobacco which can adapt to diffirences of geographic conditions quickly and efficiently is known as one of the agricultural plants which have best ability to adapt. DNA-free genome editing can reduce some limitations. These methods allow us to create gene specific mutations to increase resistance against biotic stress factors. Additionally, they can be used to demonstrate the functions the genes. Consequently, modern genome editing tecnics such as ZFN, TALEN CRISPR/Cas9 apeared as powerful genome editing tools. Because of its low cost and applicability, CRISPR/Cas9 has become most popular genome editing tool in the last 8 years. Proteins of Argonaute gene family is one of the most important protein families of plants. Argonaute gene family can be found in many species and has very important role in RNA-medieted gene silencing. Proteins of this gene family has two domains (PAZ and PIWI) which have critic roles in stress respoonse and development. Previous studies demonstrated that there are diffirence in gene expression of AGO genes under abiotic stress such as drought, salinity, high temperature and, low temperature. Moreover, there are some studies showed funtions of AGO genes in cell expansion, cytoskeleton and, programmed cell death. AGO7 (LOC107784577) is chosen based on homology of other model organisms, and knocked-out using CRISPR/Cas9. The results showed that there are diffirences in morphology and physiology between AGO7 and wild-type plants.