Geobacillus Kaustophilus'a (HTA426) Ait Hücre İçi Kollajenazın (GK2549) Klonlanması ve Heterolog İfadesi

Abstract

Kollajenazlar (3.4.24.3) hayvan bağ dokusunun temel bileşeni olan kollajeni peptid bağlarını kopararak parçalayan bir metalloproteazdır. Bu enzimler, gıda teknolojisi, sağlık sektörü, deri sanayisi, hücre kültürlerinin hazırlanması, kozmetik endüstrisi, farmasötik bileşiklerin üretimi ve fresklerin biyorestorasyonu gibi birçok alanlarda kullanılmaktadır. Tez çalışmasında Geobacillus kaustophilus'a (HTA426) ait kollajenaz (GK2549) geninin Escherichia coli'ye klonlanması, heterelog ifadesi ve sekresyonu üzerine çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Bu amaç için öncelikle kollejenaz geni bir ekspresyon vektörü olan pET14b plazmidine klonlanmıştır. Hücre dışına sekresyon çalışmaları için daha sonra proteinin N-terminaline OmpA (Outer membrane protein A) proteinine ait sinyal sekansı eklenmiştir. Yapılan restriksiyon haritalama ve dizi analizleri sayesinde doğrulaması yapılan rekombinant vektörler (pET14b/GeoKoll ve pET14b/ssGeoKoll) E. coli BL21(DE3) suşuna transformasyonları gerçekleştirilmiştir fakat sadece pET14b/GeoKoll rekombinant plazmidi başarılı sonuç vermiştir. Sonuç olarak; G. kaustophilus (HTA426)'a ait kollajenaz (GK2549) geni yapılan dizi analizleri sonucunda katalitik aktivitesi henüz açıklanamamış proteazların bulunduğu U32 ailesi içerisinde sınıflandırıldığı ve yüksek bir substrat seçiciliğine sahip olduğu anlaşılmıştır (Duarte et al., 2016). E. coli BL21(DE3) suşundan saflaştırılan GeoKoll enzimi ile yapılan aktivite deneyleri sonucunda enzimin sentetik bir kollejenaz substratı olan FALGPA'yı ticari muadiline göre çok yavaş bir şekilde parçalayabildiği anlaşılmıştır. Enzim aktivitesi zimogram analizleri ile belirlenmeye çalışılmıştır. Piyasadan alınan farklı kollajen çeşitleriyle yapılan zimogram analizleri sonuçlarına göre GeoKoll enzimi, balık kollajenine (Koll.1) karşı aktivite göstermemiştir. Enzim, sığır kollajeni (Koll.2) ile yapılan zimogram analizlerinde ise 55 °C'de zayıf bir aktivite göstermiştir.Collagenase (3.4.24.3) is a metalloprotease that breaks down collagen, the main component of animal connective tissue, by breaking peptide bonds. These enzymes are used in many fields such as food technology, health sector, leather industry, preparation of cell cultures, cosmetics industry, production of pharmaceutical compounds and biorestoration of frescoes. In the thesis study, studies were carried out on the cloning, heterologous expression and secretion of the collagenase (GK2549) gene of Geobacillus kaustophilus (HTA426) into Escherichia coli. For this purpose, firstly, the collagenase gene was cloned into an expression vector plasmid pET14b. For extracellular secretion studies, the signal sequence of the OmpA (Outer membrane protein A) protein was then added to the N-terminus of the protein. Recombinant vectors (pET14b/GeoKoll and pET14b/ssGeoKoll) were confirmed by restriction mapping and sequence analyzes. Then they were transformed to E. coli BL21(DE3) strain, but only pET14b/GeoKoll recombinant plasmid yielded successful results. As a result of the sequence analysis of the collagenase (GK2549) gene belonging to G. kaustophilus (HTA426), it has been understood that it is classified in the U32 family, which includes proteases whose catalytic activity has not yet been explained, and has a high substrate selectivity (Duarte et al., 2016). As a result of activity experiments with the GeoKoll enzyme purified from E. coli BL21(DE3) strain, it was understood that the enzyme can degrade FALGPA, a synthetic collagenase substrate, very slowly compared to its commercial counterpart. Enzyme activity was tried to be determined by zymogram analysis. According to the results of zymogram analyzes made with different types of collagen purchased from the market, GeoKoll enzyme did not show activity against fish collagen (Koll.1). The enzyme showed a weak activity at 55 °C in zymogram analyzes with bovine collagen (Koll.2).