Mirna'ların CRISPR Sistemi Kullanılarak Susturulmasıyla Kuraklığa Tolerant Domates Bitkisinin Geliştirilmesi

Abstract

Domates, iklim değişikliği ile yoğunlaşan kuraklık nedeniyle verim kayıpları yaşayan dünya çapında önemli bir üründür. Son çalışmalar, mikroRNA'nın abiyotik stresler altında gen ifadesinin temel düzenleyicileri olduğunu vurgulamıştır. Ne yazık ki, kuraklık stresi altındaki rolleri yeterince araştırılmamıştır. Bu çalışma, mikroRNA'nın kuraklık toleransındaki rolünü araştırmayı ve CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak potansiyel kuraklığa toleranslı domatesler geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu çalışmada, kuraklığa duyarlı iki miRNA (sly miR5302b & sly-miR9477) daha önce mevcut transkriptomik verilerden seçilmiştir. Bu miRNA'lara özgü sgRNA'lar tasarlanmış ve Golden Gate klonlama sistemi kullanılarak pHSE401 vektörüne yerleştirilmiştir. Tasarlanan plazmid elektroporasyon yöntemi kullanılarak Agrobacterium tumefaciens'e aktarılmıştır. Crocker domates çeşidinin on günlük kotiledon yaprakları Agrobacterium aracılı transformasyon yöntemi kullanılarak dönüştürülmüştür. İşlemden sonra, eksplantlar kallus oluşumunu indüklemek için seçim ortamında kültüre alınmıştır. Rejenere edilen sürgünler daha sonra kök indüksiyonu için köklendirme ortamına aktarılmış ve ardından dış ortama alışmak ve meyve oluşumu için seraya yerleştirilmiştir. Transgenik hatlar PCR ve Sanger dizilimi ile doğrulandıktan sonra, kuraklık toleransı ve gen ifadesini analiz etmek için üç hat seçilmiştir. Kuraklık stresi altında transgenik ve yabani tip bitkiler arasındaki karşılaştırmalı analiz, transgenik hatların toleransını göstermiş ve iklime dayanıklı tarım için potansiyellerini güçlendirmiştir. Bu çalışma, miRNA'nın kuraklığa tolerans sağlamada önemli bir rol oynamasını sağlayarak, kodlamayan RNA'ların önemli düzenleyici moleküller olarak daha geniş potansiyelini ve kuraklığa dirençli domateslerin geliştirilmesi için potansiyel atılımları vurgulamaktadır.Tomato is a major crop worldwide, suffering yield losses due to drought, intensified by climate change. Recent studies highlighted microRNA as the key regulators of gene expression under abiotic stresses. Unfortunately, their role under drought stress remains under-investigated. This research aims to investigate the role of microRNA in drought tolerance and to develop potential drought-tolerant tomatoes using the CRISPR/Cas9 system. In this study, two drought-responsive miRNAs (sly miR5302b & sly-miR9477) were selected from previously present transcriptomics data. sgRNAs specific to these miRNAs were designed and inserted into the pHSE401 vector using the Golden Gate cloning system. The designed plasmid was transferred to Agrobacterium tumefaciens using the electroporation method. Ten-day-old cotyledon leaves of the tomato variety Crocker were transformed using Agrobacterium–mediated transformation method. After the treatment, the explants were cultured on the selection media to induce callus formation. The regenerated shoots were then transferred to rooting media for root induction and then transferred to the greenhouse to acclimatize to the external environment and fruit formation. After transgenic lines confirmation by PCR and Sanger sequencing, three lines were selected to analyze drought tolerance and gene expression. Comparative analysis between transgenic and wild-type plants under drought stress demonstrated the tolerance of transgenic lines, reinforcing their potential for climate-resilient agriculture. This study provides a significant role of miRNA in conferring drought tolerance, emphasizing the broader potential of non-coding RNAs as crucial regulatory molecules, and potential breakthroughs for developing drought-resilient tomatoes.