Boğalarda Testiküler Doku Kriyoprezervasyonunun Poli (Adp-Riboz) Polimeraz-1 (Parp-1) Gen Ekspresyon Seviyesi Üzerine Etkisi

Abstract

Sunulan tez çalışması boğalarda testiküler doku ve epididimal sperma kriyoprezervasyonu işlemlerini kapsamakta ve bu uygulamaların spermatolojik parametreler, testiküler dokuda hücre canlılığı ve bir DNA onarım enzimi olan PARP-1 geninin ekpresyonu üzerine etkilerinin araştırılmasını amaçlamıştır. Çalışmada mezbahanede kesimi yapılan 2 yaşından büyük 20 boğaya ait testisler kullanıldı. Kauda epididimislerden elde edilen spermalar spermatolojik değerlendirmelerden sonra payet yöntemine göre sıvı azot buharında donduruldu ve sıvı azotta (-196°C) saklandı. Testislerden elde edilen testiküler doku parçaları ise Dimetilsülfoksit (DMSO) ve Etilen Glikol (EG) kriyoprotektanlarını içeren sulandırıcılar içerisinde, kriyotüplerde, yavaş dondurma yöntemiyle donduruldu ve sıvı azotta (-196°C) saklandı. Spermalar taze ve çözüm sonrası motilite, kinematik parametreler, canlılık, plazma membran bütünlüğü, morfoloji ve kromatin kondenzasyonu yönünden değerlendirildi. Taze spermaya ait total motilite (%85,898 ± 12,83), progresif motilite (%54,02 ± 15,77) ve kinematik parametre değerlerinin, çözüm sonrası total motilite (%57,627 ± 13,13), progresif motilite (%29,607 ± 10,76) ve kinematik parametre değerlerine kıyasla anlamlı derecede yüksek olduğu gözlendi (P<0,05). Çözüm sonrası sperma örneklerinde plazma membran bütünlüğü ve canlılık oranında önemli düşüşler, kromatin kondenzasyonu ile baş, orta kısım ve kuyruk bölgelerine ait morfolojik bozukluklarında ise artış gözlemlenmiştir (P<0,05). Bu bulgular, kriyoprezervasyon işlemi sırasında oluşan hücre içi ve hücre dışı buz kristalleri, ozmotik stres, artan ROS seviyeleri gibi durumların spermatolojik parametreler üzerinde olumsuz etkiler yarattığını göstermektedir. Dondurulan testiküler dokuda çözüm sonrası DMSO ve EG'nin, hücre canlılığı üzerindeki etkileri değerlendirildiğinde, EG ile dondurulan testiküler dokuların hücre canlılığı değerlerinin (45.7 ± 10), DMSO ile dondurulan (51.2 ± 7.7) kıyasla istatistiksel olarak anlamlı ölçüde daha düşük olduğu gözlendi (P<0,05). Doku ve sperma örneklerindeki gen ifadesi üzerine her iki kriyoprotektanın etkileri incelendiğinde DMSO grubunda yer alan doku örneklerinde, taze doku örneklerine kıyasla gen ifadesinin ortalama 0.197±0.274 kat arttığı, EG grubunda yer alan doku örneklerinin ise 0.171±0.196 kat arttığı belirlenmiştir. Çözüm sonrası epididimal sperma örneklerinde, taze sperma örneklerine kıyasla, gen ifade düzeylerinde ise ortalama 1.207±1.08 kat arttığı belirlenmiştir. Sonuçlar kriyoprezervasyonun doku ve hücrelerde spesifik yolakları aktive ederek hücresel onarım mekanizmalarını başlatabileceğini ve gen ekspresyonunu etkileyebileceği düşündürmektedir.The presented thesis study covers testicular tissue and epididymal semen cryopreservation procedures in bulls and aims to investigate the effects of these applications on spermatological parameters, cell viability in testicular tissue, and the expression of the PARP-1 gene, a DNA repair enzyme. Testes of 20 bulls over two years old, slaughtered in a slaughterhouse, were used in the study. After spermatological evaluations, the semen obtained from the kauda epididymis was frozen in liquid nitrogen vapor according to the straw method and stored in liquid nitrogen (-196°C). Testicular tissue pieces obtained from the testicles were frozen by the slow freezing method in cryotubes, in extenders containing Dimethylsulfoxide (DMSO) and Ethylene Glycol (EG) cryoprotectants, and stored in liquid nitrogen (-196°C). Fresh and post-thaw semen was evaluated in terms of motility, kinematic parameters, viability, plasma membrane integrity, morphology, and chromatin condensation. Total motility (85.898 ± 12.83%), progressive motility (54.02 ± 15.77%), and kinematic parameter values of fresh semen, It was observed that was significantly higher after thawing compared to total motility (57.627 ± 13.13%), progressive motility (29.607 ± 10.76%) and kinematic parameter values (P<0.05). Significant decreases in plasma membrane integrity and viability and increased chromatin condensation and morphological disorders in the head, middle part, and tail regions were observed in post-thaw semen samples (P<0.05). These findings show that conditions such as intracellular and extracellular ice crystals, osmotic stress, and increased ROS levels formed during the cryopreservation process negatively affect spermatological parameters. When the effects of DMSO and EG on cell viability after thaw in frozen testicular tissue were evaluated, it was observed that the cell viability values of testicular tissues frozen with EG (45.7 ± 10) were statistically significantly lower than those frozen with DMSO (51.2 ± 7.7) (P <0.05). When the effects of both cryoprotectants on gene expression in tissue and semen samples were examined, gene expression increased on average 0.197±0.274 times in the tissue samples in the DMSO group compared to fresh tissue samples. It was determined that the tissue samples in the EG group compared to fresh tissue samples increased by 0.171±0.196 times. It was determined that gene expression levels increased by an average of 1.207±1.08 times in post-thaw epididymal semen samples compared to fresh semen samples. The results suggest that cryopreservation may initiate cellular repair mechanisms and affect gene expression by activating specific pathways in tissues and cells.