CRISPR-Cas9 Sistemi Kullanılarak Erkek Kısır Tütün (Nicotiana Tabaccum) Bitkilerinin Geliştirilmesi

Abstract

Gen düzenleme teknolojileri ile erkek kısırlık genlerini hedef alarak işlevsiz allel varyantlarını elde etmek mümkündür. Geleneksel ıslahın aksine, CRISPR / Cas9 sistemi yoluyla erkek kısır hatların geliştirilmesi verimli ve kullanışlı olup daha az zaman gerektirir. CRISPR tabanlı genom düzenleme teknolojileri için en önemli faktörlerden biri uygun rehber RNA'ların (gRNA) tasarlanması ve seçimidir. Bu çalışmada ACOS geni, erkek kısır bitkiler elde etmek için tütün genomunda hedeflemiştir. Potansiyel gRNA'lar Benchling yazılımı ile tasarlanmıştır. Hedef dışı potansiyeli daha düşük olan yüksek özgüllük skoruna sahip potansiyel gRNA' lardan ikisi, bitki ekspresyon vektörüne (pKI1.1R) klonlanmıştır. Tütün bitkilerine hazırlanan vektörün aktarımı, Agrobacterium tumefaciens (AGL1) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. sgRNA1 ve sgRNA2 için sırasıyla toplam 12 ve 13 adet olmak üzere T0 tütün hattı elde edilmiştir. Hedeflenen genom bölgesi için spesifik primerler kullanılarak çoğaltılan PCR ürünü, sanger sekanslama ile dizilenmiştir.By introduction of gene editing technologies, targeting the male sterility genes is now possible to obtain dysfunctional allele variants. In contrast to conventional breeding, development of male sterile lines through CRISPR/Cas9 system is efficient, convenient and requires less time. Designing and selection of appropriate guide RNAs (gRNAs) are one of the most important factors for CRISPR-mediated genome editing technologies. In present study, ACOS gene was targeted in tobacco genome to obtain male sterile plants. Potential gRNAs were designed through Benchling software. Two of the potential gRNAs having high specificity score with less off-target potential was cloned into plant expression vector (pKI1.1R). Generation of genome edited tobacco plants was achieved by using Agrobacterium tumefaciens AGL1. A total of 12 and 13 T0 genome edited putative tobacco lines were obtained for sgRNA1 and sgRNA2, respectively. To evaluate genome editing rates, PCR product amplified by using spesific primers for targeted genome region was sequenced with Sanger sequencing.