Yüksek Performanslı Likid Kromatografi (HPLC) Yöntemi İdrar Oksalik Asit ve Sitrik Asit Düzeylerinin Belirlenmesi

Abstract

Üriner sistemde kalsiyum oksalat taşı bulunan hastaların klinik değerlendirilmesindeve tedavisinde, idrar oksalik ve sitrik asit düzeylerinin saptanması önem arzetmektedir.İdrardaki özel matriks ve diğer anyonların varlığı bu ölçümü zorlaştırmaktadır. Bu nedenlebiz, HPLC ile idrar ve diğer vücut sıvılarında oksalik ve sitrik asit düzeylerini belirleyebilenve rutin amaçlı uygulanabilen bir yöntem geliştirmeyi amaçladık.Klinik bölümler tarafından 24 saatlik ve spot idrarda oksalat ve sitrat düzeyi istenen100 hasta çalışmaya dahil edildi. İdrar sitrik asit düzeyi geliştirdiğimiz metodla organik likitmembran tekniği kullanarak; oksalik asit düzeyi ise kinoksalin'e dönüştürme metoduylaölçüldü. Sitrik asit ölçümü için; HPLC cihazı 25oC sıcaklık, 1.7 ml/dk akış hızı, 210 nm UVdedektör ve C18 kolonu, oksalik asit ölçümü için ise 25oC sıcaklık, 1.7 ml/dk akış hızı, 314nm UV dedektör ve C18 kolonu kullanıldı. Kalibratör ve kontrol sonuçları değerlendirilereknumunelerin çalışılabilirliğine karar verildi.Kromatogramda internal standart ve sitrat retansiyon süreleri sırasıyla, 2±0.2 ve3.7±0.4 dk olduğundan sitrat için çalışma süresi 6 dk olarak ayarlandı. Oksalat çalışma süresiise; internal standart ve oksalat retansiyon süreleri sırasıyla, 11±2 ve 16±2 dk olduğundan, 20dk olarak ayarlandı.Sitratın ve oksalatın plazma konsantrasyonunun belirlenmesinde, internal standartmetod kullanıldı. Sitrat standartları farklı iki konsantrasyonda (1.25mmol/L ve 5mmol/L)çalışıldığında gün-içi %CV değerleri sırasıyla, %4.29 ve %5.37, günler-arası %CV değerlerisırasıyla, %2.78 ve %3.13 olarak bulundu ve 0,03-20 mmol/L aralığında lineerite gösterdiğitespit edilmiştir (r=0.99, p<0.001). Üç farklı konsantrasyonda yapılan geri kazanımçalışmasında sırasıyla %101.2, %100, %99.7 ve fonksiyonel sensitivitesi 0.009 mmol/Lolarak bulunmuştur.Oksalat standartları farklı iki konsantrasyonda (0.312 mmol/L ve 2.5 mmol/L)çalışıldığında gün içi %CV değerleri sırasıyla, %5.5 ve %4.18; günler arası %CV değerlerisırasıyla, %3.72 ve %2.26 olarak bulundu ve 0.03-20 mmol/L aralığında lineerite gösterdiğitespit edildi (r=0.99, p<0.001). Üç farklı konsantrasyonlarda yapılan geri kazanımçalışmasında ise sırasıyla %102, %99.3, %99.5 ve fonksiyonel sensitivitesi 0.013 mmol/Lolarak bulunmuştur.Sonuç olarak geliştirdiğimiz bu metodla organik likit membran tekniği ile idrar gibikarmaşık matrikse sahip biyolojik numunelerde bile sorunların büyük oranda çözüldüğügörülmektedir. Ayrıca HPLC cihazı ile geliştirilen bu metod literatürdekilere göre daha hızlı,ekonomik, çalışılması kolay, tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği yüksektir. Bu nedenle idrar ve diğer vücut sıvılarında oksalik ve sitrik asit düzeylerini belirlemede rutin olarakkullanılabileceğini düşünmekteyiz.Anahtar kelimeler: Sitrik asit, oksalik asit, HPLCDetermination of urine oxalic and citric acid levels has importance at the clinicalassessment and treatment of the patients presenting with renal calcium oxalat Stone. Due to itsspecial matrix and anions, it is quite complicated to make this kind of measurements in urine.Therefore, we aimed to develop an original method based on HPLC to determine the oxalicand citric acid levels in urine samples and the other body fluids in clinical laboratory.One hundred patients that were examined their oxalate and citrate levels in the 24-hoururine and spot urine by the clinical departments included in the study. Urine citric acid levelwas measured by organic liquid membrane technique, while oxalic acid level was measuredby ?transformation to quinoxaline? method. For the measurement of citric acid, HPLC systemwas run at the temperature of 25º C, flow-rate of 1.7 ml/min, wavelength of 210 nm usingC18 column; as to oxalic acid measurement; temperature was at 25º C, flow rate 1.7 ml/min,wavelength 314 nm and column was C18. Before assaying urine samples, one-pointcalibration and QC study were done.To measure both citrate and oxalate concentrations, we used internal standard methodas calibration method. For the assay of citrate variations within-day and between-day as %CVwe selected 1.25 mmol/L and 5.0 mmol/L concentrations and found to be % 4.29 and % 5.37and %2.78 ve %3.13 respectively. It was linear at the range of 0,03-20 mmol/L (r=0.99,p<0.001) and functional sensitivity was 0.009 mmol/L. As for the recovery, it was done onthree different levels (20, 5, 1.25 mmol/L) and found to be %101.2, %100, and %99.7respectively.For oxalate assay, within-day and between-day precisions were % 5.5 and % 4.18 and% 3.72 and % 2.26 respectively. It revealed linearity at the range of 0.03-20 mmol/L (r= 0.99,p<0.001) and its functional sensitivity was found to be 0.013 mmol/L. At three differentlevels of oxalate (5, 0.625, 0.312) our method showed recovery of % 102, % 99.3, % 99.5Since internal standard (tartaric acid) and citrate peaks came out at the retention times of2.0±0.2 and 3.7±0.4 respectively, running time was set to 6 minutes. As for the oxalate, therunning time was adjusted to 20 minutes because oxalate and its internal standard (p-aminoacetophenone) revealed the retention times of 16±1 and 11±1 respectively.In conclusion, we soak to measure oxalate and citrate levels especially in urinesamples on HPLC platform with an original method of organic liquid membrane and chemical derivation. Our method was more economic, reproducible, reliable, easier to work, and fasteras compared to the methods in the literatures. For these reasons, we suggest that it can be usedroutinely in determining oxalic and citric acid levels in the urine and the other body fluids.Keywords: Citric acid, oxalic acid, HPLC