Termofilik Streptomyces Spp.'lerin Moleküler Taksonomisi

Abstract

TERMOF L K Streptomyces spp.'LER N MOLEKÜLER TAKSONOM SÖZETStreptomyces cinsi, ticari olarak önemli bileşiklerin umut verici kaynağı olması vegünümüz moleküler biyolojik metotların fenotipik özelliklere dayanan gelenekselstreptomycetes sistematiği üzerinde artan bir etki göstermesi, cinsi sistematiğin merkezikonumuna getirmektedir. Moleküler sistematik metotlar özellikle de 16S rDNAsekanslama, streptomycetes sistematiği üzerinde giderek artan bir etkiye sahiptir.Benzer olarak, PCR-restriksiyon fragment uzunluk polimorfizmi (RFLP), PCR-rastgeleamplifiye edilmiş polimorfik DNA (RAPD) ve ribotyping gibi moleküler parmak iziteknikleri, yakın akraba streptomycetes türlerinin tür içi ve türler arası ilişkileri tespitetmede kullanılmaktadır.Bu çalışmadaki temsilci test organizmaları, SSM, COMPLETE analizi kullanılarakoluşturulan nümerik kümelerden seçilmiştir (Öztürk, 2000). 9 toprak izolatı, 9 tip örneğive 14 referans izolattan oluşan toplam 32 termofilik organizma 16S rDNA RFLPparmak iz'leri için araştırıldı. Test organizmalarının amplifiye edilen 16S rDNA'sıEcoR I, Hind III, Pst I, Sal I, Spho I ve Sau3 AI restriksiyon endonükleaz enzimlerikullanılarak kesildi ve agaroz jelde elektroforez edildi. EcoR I, Pst I ve Sau3 AIendonükleaz enzimleri amplifiye edilen 16S rDNA'ları kesti fakat, Hind III, Sal I veSpho I kesmedi. EcoR I, Pst I ve Sau3 AI enzimleri amplifiye edilen DNA'ları 171-1125 baz çifti aralığında kesti. 3 restriksiyon endonükleazdan Sau3 AI, testorganizmaların çoğunu farklılaştıran RFLP patternleri oluşturdu. PCR-RFLP patternleri,streptomycetes türleri arasındaki ilişkileri tespit etmek için hızlı ve doğru bir metodolarak gösterilmiştir.Test organizmalarının DNA amplifikasyon parmak iz'leri (RAPD) M13f primerkullanılarak değerlendirildi. 8 temsilci test izolatı ve geçerliliği olan 7 Streptomycestürü, bu metot ile DNA düzeyinde farklılaştı. Temsilci test organizmalarından eldeedilen amplifikasyon ürünlerinin fragment uzunlukları 225 ve 1625 baz çifti aralığındaçeşitlilik gösterdi. Sonuçlar RAPD analizinin tür düzeyinde streptomyceteslerinsınıflandırılması ve identifikasyonunda kullanılabileceğini göstermektedir.8 temsilci test izolatının 16S rDNA sekansları EMBL-Gen bankasından elde edilentemsilci termofilik ve mezofilik streptomycetes nükleotid sekansları ile AL 16Sprogramı kullanılarak dizilendi. Filogenetik ağaçlar 4 algorithm kullanılarakoluşturuldu: the neighbour joining, maximum-parsimony, least-squares ve maximum-likelihood metotları. Filogenetik analizler, E1205 ve E1109 izolatlarının Streptomycesthermovulgaris DSM 40444T ve E1125 izolatının Streptomyces thermodiastaticus DSM40573T ve E1351 izolatının Streptomyces somaliensis DSM 40267T ve NT011, NT471,NT508 ve NT568 izolatlarının Streptomyces thermocarboxydus DSM 44293T türü ileen yakın akraba olduğunu gösterdi. Bu ve daha önceki çalışmalardan elde edilenfenotipik veriler ile birlikte moleküler sistematik araştırmalar test izolatlarının türstatüsünde yer alabileceğini göstermektedir.Anahtar kelimeler: Termofilik Streptomyces, Moleküler taksonomi.MOLECULAR TAXONOMY OF TERMOPHILIC Streptomyces spp.ABSTRACTThe genus Streptomyces remanis a center of systematics, not only becausestreptomycetes are still the most importance source of commercially significantcompounds, but also because current molecular biological methods are having anincreasing impact on conventional streptomycetes systematics that are based onphenotypic characteristics. Molecular systematic methods, notably 16S rDNAsequencing, are having an ever increasing impact on streptomycetes systematics.Similarly, molecular fingerprinting techniques, such as PCR-restriction fragment lengthpolymorphism (RFLP), PCR-randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) andribotyping are being used to establish relationships within and between closely relatedstreptomycete species.In this study, representatives of the test organisms have been selected fromnumerically defined clusters which consist using SSM, COMPLETE analyses (Öztürk,2000). Of the total 32 thermophilic organisms consist of 9 soil isolates, 9 type strainsand 14 referance isolates were examined for RFLP profiles of the ribosomal RNAgenes. Amplified 16S rDNA of test organisms was digested by using six restrictionendonucleases, EcoR I, Hind III, Pst I, Sal I, Spho I and Sau3 AI and electrophoresed onagarose gels. EcoR I, Pst I and Sau3 AI endonucleases digested the amplified 16SrDNA but no Hind III, Sal I and Spho I. EcoR I, Pst I and Sau3 AI digested theamplified DNA in the size range 171-1125 bp. Of 3 restriction endonucleases, Sau3 AIproduced RFLP patterns that differentiated most of the test organisms. PCR-RFLPpatterns have provided a rapid and accurate method to establish relationships in betweenstreptomycetes species.DNA amplification fingerprints (RAPD) of the test organisms were evaluated usingthe primer M13f . Representatives of 8 test isolates and 7 validly described species ofStreptomyces were differentiated at the DNA level with this method. The fragmentlengths of amplification products obtained for the representative test organisms variedbetween 225 and 1625 bp. The results indicated that RAPD analysis could be used tothe classification and identification of streptomycetes to the species level.The 16S rDNA sequences of 8 representative test isolates were aligned manuallywith represantative thermophilic and mesophilic streptomycete nucleotide sequencesobtained from the EMBL-GenBank databases by using the AL 16S program.Phylogenetic trees were inferred with by using the following four algorithms: theneighbour joining, maximum-parsimony, least-squares and maximum-likelihoodmethods. The phylogenetic analyses showed that isolates E1205 and E1109 were mostclosely related to Streptomyces thermovulgaris DSM 40444T and isolate E1125 toStreptomyces thermodiastaticus DSM 40573T and isolate E1351 to Streptomycessomaliensis DSM 40267T and isolates NT011, NT471, NT508 and NT568 to44293T.Streptomyces thermocarboxydus DSM The molecular systematicinvestigations, together with phenotipic data derived from this and previous studies,indicate that the test isolates merit species status within the genus Streptomyces.Key Words: Termophilic Streptomyces, Molecular taxonomy.