Kemikli Balıklarda RNA'ya Bağlanan Larp6 Proteinlerinin N-Terminal Alanının Karakterizasyonu

Abstract

Balık ve insan proteinleri yapı ve fonksiyon bakımından oldukça benzer özellikler göstermektedir. Bu nedenle insan proteinlerinin kullanılmadığı biyokimyasal ve moleküler çalışmalarda balıklar kullanılabilmektedir. Tüm La-ilişkili proteinler (LARP'lar), iki bağımsız olarak katlanan alandan oluşan 'La Modül' olarak adlandırılan korunmuş bir RNA bağlanma alanını paylaşır. La Modül, La motif (LaMot) ve RNA Tanıma Motifi (RRM) alanlarından oluşur. Her bir LARP alt ailesi ek protein domaini (alanı) ve RNA ligand özellikleriyle ayırt edilir. Örneğin, LARP6 alt familyası, fonksiyonu bilinmeyen LaM ve S1 İlişkili Motif (LSA motifi) olarak adlandırılan korunmuş bir C-terminal motifi ile karakterize edilir. LARP6 alt familyasının biyolojik işlevi henüz tanımlanmamıştır. Bununla birlikte, La Modülünün dışındaki LARP6 alanlarının tam uzunluktaki protein yapısının RNA bağlanma aktivitesine katkıda bulunup bulunmadığı veya modüle edip etmediği belirsiz kalmıştır. Bu belirsizliğin anlaşılmasına katkıda bulunmak için üç türden (memeli Homo sapiens ve iki kemikli balık, Xiphophorus maculatus ve Danio rerio) N-terminal domain-LaModül LARP6 proteinlerinin yapısını ortaya çıkartmak için klonlama işlemi sonrası saflaştırma basamakları uygulanmıştır. N-terminal alanının (insan LARP6 numaralandırma şemasındaki 1-70 amino asitleri), RNA bağlanma aktivitesini modüle eden kararlı bir NTD-La Modül çoklu domain yapısını oluşturmak için La Modül (LaMod, 70-300 amino asitleri) ile etkileştiği hipotezi varsayılmıştır. Bu hipotez doğruysa, LARP6 içinde moleküller arası etkileşimin ilk gösterimini temsil edecektir. Bu sonuç, hücreler içindeki LARP6'nın N-terminal domain La Modül yapısı ve işlevi için yeni bir model oluşturacaktır. Çalışmamızın sonuçlarına göre (i) N-terminal domain ve LaModül'ün RNA'ya kararlı bir biçimde bağlandığı görülmüştür, (ii) bu bağlanma sırasında balıkların insan proteinlerine göre daha kararlı bir yapı ve fonksiyon gösterdiği bulunmuştur ve (iii) balık proteinlerinin gerçekten insan proteinleri yerine deneysel amaçlarla kullanılabildiği desteklenmiştir.Fish and human proteins are very similar in structure and function. For this reason, fish can be used in biochemical and molecular studies where human proteins are not used. All La-related proteins (LARPs) share a conserved RNA binding domain called the 'La Module' consisting of two independently folded domains. La Module contains La motif (LaMot) and RNA Recognition Motif (RRM) domains. Each LARP subfamily is distinguished by additional protein domain and RNA ligand properties. For example, the LARP6 subfamily is characterized by a conserved C-terminal motif, termed the 'LSA motif', whose function is unknown. The biological function of the LARP6 subfamily has not yet been identified. However, it remains unclear whether the full-length protein structure of the LARP6 domains outside the La module contributes to or modulates RNA binding activity. In order to contribute to the understanding of this ambiguity purification steps were carried out after cloning to reveal the structure of the N-terminal domain-LaModule LARP6 proteins from three species (mammalian Homo sapiens and two bony fish, Xiphophorus maculatus and Danio rerio). We assume the hypothesis that the N-terminal domain (1-70 amino acids in the human LARP6 numbering scheme) interacts with the La Modulus ('LaMod', amino acids 70-300) to generate a stable NTD-LaModule multiple domain structure modulating RNA binding activity. If this hypothesis is true, it will represent the first demonstration of intermolecular interaction in LARP6. This result will be a new model for the N-terminal domain LaModule structure and function of LARP6 in cells. According to the results of our study, (i) the N-terminal domain and LaModule were found to bind to RNA in a stable manner, (ii) fish were found to have a more stable structure and function than human proteins during this binding, and (iii) it was supported that fish proteins could be used for experimental purposes instead of human proteins.