Domateste Kök-ur Nematodlarına Karşı Geleneksel ve CRISPR-dCas9 Tabanlı Aşırı İfade Sistemleri Optimizasyonu

Abstract

Bitki paraziti nematodlar (PPN'ler) dünya çapında çeşitli bitkiler ve mahsuller için önemli bir ekonomik zorluk teşkil etmektedir. Bitkiler, nematod üremesini engellemede ve M. incognita'nın verdiği zararı en aza indirmede kritik öneme sahip olan, topluca bitki kök eksüdası olarak adlandırılan, suda çözünen ve uçucu organik bileşiklerin (VOC) çeşitli bir kombinasyonunu toprağa salmaktadır. Çalışmamız, köke özgü promotörler (SIRPL11) altında geleneksel aşırı ekspresyon ve CRISPR-ACT3.0 teknolojisini kullanarak Domates bitkisinin köklerinde palmitik asit ve türevlerinin sentezlenmesinden sorumlu çoklu endojen genlerin (FATA, FATB1, FATB2 ve FATB3) ekspresyonunu artırmaya odaklanmaktadır. Geleneksel aşırı ekspresyon yaklaşımında, yabani tipe kıyasla gen ifadesinin ve palmitik asit içeriğinin yukarı regülasyonu gözlenmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada değerlendirilen hatlar arasında M. incognita'nın üreme indeksindeki (% RI) azalma % 6,5 ila % 71,4 arasında değişmiştir. Geleneksel aşırı ekspresyonun dezavantajı nedeniyle CRISPR-Act3.0 da kullandık. Genlerin aktivasyon etkinliğini sağlamak için, bu durumda her bir genin promotör bölgesini hedeflemek üzere iki tek kılavuz RNA (sgRNA) kullanılmıştır. Bundan sonra, daha kapsamlı bir gen aktivasyon yaklaşımı için çoklu sgRNA kaseti tek bir vektörde birleştirilir. CRISPR-Act3.0 vektörlerinin aktivasyon etkinliğini ve hızlı değerlendirmesini belirlemek için, in vitro Agrobacterium rhizogenes aracılı saçak kök transformasyonu (HRT) Domates'te optimize edilmiştir. A. rhizogenes suşu, birlikte yetiştirme süresi, Domates genotipi ve eksplant tipi dahil olmak üzere farklı parametreler değerlendirilmiştir. Genlerimizin en yüksek transformasyonu, 10 günlük hipokotil ve kotiledon cv. Bobcat'in 3 ve 4 gün boyunca aşılanmış hipokotil ve kotiledonlarında gözlenmiştir. İki hafta sonra, köklerin hipokotilden büyümeye başladığını fark ettik, oysa 4 haftadan daha uzun bir süre sonra kotiledonlardan tüylü kökler gözlemledik. CRISPR-Act3.0 sisteminin genlerimizi aktive etmedeki etkinliği yaklaşık 2,5 ila 18 kat arasındaydı. Bulgularımız, CRISPR-Act3.0 sistemlerinin multipleks gen aktivasyonunu sağlamadaki etkinliğine dair kanıtlar sunmakta ve böylece ekonomik açıdan önemli olan bu türde transkripsiyonel aktivasyonun uygulanabilirliğini artırmaktadır.

Plant-parasitic nematodes (PPNs) pose a considerable economic challenge for various plants and crops worldwide. Plants release a diverse combination of water-soluble and volatile organic compounds (VOCs) into the soil, collectively referred to as plant root exudate, which is critical in inhibiting nematode reproduction and minimizing the damage inflicted by M. incognita. Our study focuses on increasing the expression of multiple endogenous genes (FATA, FATB1, FATB2, and FATB3) responsible for synthesizing palmitic acid and its derivatives in the roots of the Tomato plant by using traditional over-expression and CRISPR-ACT3.0 technology under root-specific promoters (SIRPL11). In the traditional overexpression approach, the upregulation of gene expression and palmitic acid content was observed compared to the wild type. As a result, the reduction in the reproduction index (RI%) of M. incognita across the evaluated lines in this study varied from 6.5% to 71.4%. Because of the disadvantage of traditional over-expression we have used CRISPR-Act3.0 also. To ensure the activation efficiency of the genes, two single guide RNAs (sgRNAs), in this case, are employed to target the promoter region of each gene. After that assembling the multi-sgRNA cassette into one vector for a more comprehensive gene activation approach. For determining the activation efficiency and rapid assessment of CRISPR-Act3.0 vectors, in vitro Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation (HRT) was optimized in Tomato. Different parameters were evaluated, including A. rhizogenes strain, co-cultivation period, Tomato genotype, and explant type. The highest transformation of our genes was observed on 10-d-old hypocotyl and cotyledon of cv. Bobcat inoculated for 3 and 4 days. After two weeks, we noticed that the roots started to grow from the hypocotyl, whereas we observed hairy roots from cotyledons after more than 4 weeks. The effectiveness of the CRISPR-Act3.0 system in activating our genes was about 2.5- to 18-fold. Our findings provide evidence for the efficacy of CRISPR-Act3.0 systems in enabling multiplex gene activation, thereby enhancing the feasibility of implementing transcriptional activation in this economically significant species.