Klinik stenotrophomonas maltophilia izolatlarında sınıf 1, 2, 3 integron varlığının ve antibiyotik direnci ile ilişkilerinin araştırılması*

Abstract

Stenotrophomonas maltophilia, hastane enfeksiyonu etkeni olarak giderek artan sıklıkla karşılaşılan fırsatçı bir patojendir. Birçok farklı mekanizmaya bağlı olarak geniş spektrumlu antibiyotiklerin çoğuna dirençlidir ve bu durum klinikte tedavi seçeneklerini kısıtlamaktadır. Direnç genlerinin aktarımında rol oynayan mobil genetik elemanlar olan integronların, farklı gram-negatif bakterilerde antibiyotik direnci ile olan ilişkisi irdelenmiş olmasına rağmen, özellikle S.maltophilia için ülkemizdeki veriler oldukça sınırlıdır. Bu çalışmada, klinik S.maltophilia izolatlarında farklı sınıf integronların ve plazmid varlığının araştırılması ve bunların antibiyotik direnç profili ile ilişkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, Ocak 2011-Eylül 2012 tarihleri arasında mikrobiyoloji laboratuvarında klinik örneklerden (32 balgam, 25 trakeal aspirat, 9 idrar ve kan, 7 eksuda ve kateter, 4 steril vücut sıvısı ve yara, 2 BOS, 1 konjunktiva) izole edilen 100 S.maltophilia suşu dahil edilmiştir. İzolatlar, VITEK2 Compact (BioMerieux, Fransa) veya Phoenix 100 (BD, ABD) otomatize sistemleri ile tanımlanmış; seftazidim, trimetoprim/sülfametoksazol (SXT), levofloksasin ve kloramfenikole karşı duyarlılıkları CLSI önerileri doğrultusunda sıvı mikrodilüsyon yöntemi ile belirlenmiştir. Tüm suşlarda sınıf 1 (intI-1), sınıf 2 (intI-2), sınıf 3 (intI-3) integron gen kasetleri ve integron 5-3 korunmuş gen bölgeleri (intI-5-3CS), özgül primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile araştırılmıştır. Pozitiflik saptandığında PCR ürünlerinin nükleotid dizi analizi yapılmış, aynı zamanda bu suşlarda plazmid varlığı araştırılmış ve bulunan plazmidlerin büyüklükleri belirlenmiştir. İzolatların seftazidim, kloramfenikol, SXT ve levofloksasine karşı duyarlılık oranları sırasıyla %24, %66, %93 ve %95 olarak saptanmış; MİK50 ve MİK90 değerleri ise sırasıyla 64-128 ?g/ml, 8-16 ?g/ml, 1/19- 2/38 ?g/ml ve 1-2 ?g/ml olarak bulunmuştur. PCR yönteminde, intI-1, intI-2 ve intI-3 primerleri ile yapılan amplifikasyonda, suşların sırasıyla %12, %2 ve %10unda şüpheli bantlar elde edilmiştir. Amplifiye edilen ürünlerin dizi analizleri yapıldığında, beş izolatın intI-1 geni içerdiği, ancak hiçbirisinde sınıf 2 ve 3 intI geni bulunmadığı görülmüştür. IntI-5CS ve 3CS primerleri ile yapılan amplifikasyonda ise 20 suş şüpheli bant vermiş, dizi analizinde bunların ikisinde kuarterner amonyum direnç protein geni (qacL), birinde aminoglikozid adeniltransferaz geni (aadA) ve beşinde integronla ilişkili rekombinasyon bölgesi (attI1) geninin varlığı tespit edilmiştir. Ayrıca suşların 9 (%9)unda plazmid varlığı saptanmış, ancak bu suşların hiçbirinde integron pozitifliği izlenmemiştir. Plazmidlerin boyutları 17200, 2340, 1350, 2760, 18600, 20000, 3570-2540, 2510 ve 5000-2540 baz çifti olarak tespit edilmiştir. İzolatların antibiyotik duyarlılık profili ile intI gen bölgesi varlığı karşılaştırıldığında, antibiyotik direnç durumu ve gen bölgesi varlığı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmamıştır (p 0.05). Sonuç olarak çalışmamızda, klinik S.maltophilia suşlarında integron sınıf 1 geni ve plazmid varlığının gösterilmiş olması, hastanemizde dirençli suşların yayılımının artabileceği konusunda uyarıcı bir veri olarak değerlendirilmiştir.

Stenotrophomonas maltophilia is an opportunistic emergent pathogen causing hospital-acquired infections. It is resistant to majority of the broad spectrum antibiotics due to several mechanisms which significantly limit the treatment options. Although the relationship between integrons, mobile genetic elements which play role in transferring resistance genes, and the antibiotic resistance in different gram- negative bacteria have been investigated, the data are limited in Turkey especially for S.maltophilia. The aims of this study were to detect the presence of different classes of integrons and plasmids in clinical isolates of S.maltophilia and to investigate the antibiotic resistance profiles of those isolates. One hundred S.maltophilia strains isolated from various clinical samples (32 sputum, 25 tracheal aspirates, 9 urine and blood, 7 exudates and catheters, 4 sterile body fluids and wounds, 2 CSF, 1 conjunctiva) in our microbiology laboratory during January 2011-September 2012, were included in the study. The isolates were identified by VITEK2 Compact (BioMerieux, France) or Phoenix 100 (BD, USA) automa- tized systems, and the susceptibilities of the strains to levofloxacin, chloramphenicol, ceftazidime and trimethoprim/sulfamethoxazol (SXT) were evaluated via broth microdilution method according to the CLSI recommendations. Class 1 (intI-1), class 2 (intI-2), class 3 (intI-3) integron gene cassettes and inte- gron 5-3 conserved gene regions (intI-5-3CS) were investigated by polymerase chain reaction (PCR) using specific primers in all of the strains. Nucleotide sequence analysis of PCR products was performed in case of positive result, and the presence and size of plasmids were further investigated. The suscep- tibility rates of S.maltophilia strains to ceftazidime, chloramphenicol, SXT and levofloxacin were found as 24%, 66%, 93% and 95%, respectively, while MIC and MIC values were 64-128 µg/ml, 8-16 µg/ 50 90ml, 1/19-2/38 µg/ml and 1-2 µg/ml, respectively. In PCR amplification with intI-1, intI-2 and intI-3 prim- ers, 12%, 2% and 10% of the isolates yielded expectative bands, respectively. DNA sequence analysis of the amplified products revealed five isolates to harbour intI-1 gene, while intI class 2 and class 3 genes were not detected in any of the strains. Furthermore in PCR amplification with intI-5CS and 3CS primers, 20% of the strains yielded expected bands. Sequence analysis of these amplicons revealed the presence of quaternary ammonium compound resistance protein genes (qacL) in two, aminoglycoside adenyltransferase gene (aadA) in one and integron-associated recombination site (attI1) genes in five strains. Additionally, the presence of plasmids have been detected in 9 (9%) of the strains, however all of them was integron-negative. The sizes of plasmids were 2340, 1350, 2760, 18600, 20000, 3570-2540, 2510 and 5000-2540 base pairs, respectively. When the antibiotic susceptibility patterns of strains were compared with the presence of intI gene regions, no statistically significant relationship was observed (p> 0.05). In conclusion, the demonstration of integron class 1 genes and plasmids among clinical S.maltophilia strains is regarded as a warning data to indicate the potential for spread of those resistant strains in our hospital.