Rizosfer izolatı streptomyces violaceusniger klad üyesi streptomyces sp.’lerin moleküler taksonomisi / Anıl Sazak; Danışman Nevzat Şahin

Abstract

Bu çalışmada, Doğramacı (2005) tarafından ağaç ve çalı formundaki farklı baklagil rizosferinden izole edilen ve Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gen kladına ait türlerin morfolojik ve kültürel özelliklerine göre seçilerek ilgili tip türleri ile birlikte nümerik taksonomileri gerçekleştirilmiş olan 58 rizosfer izolatının polifazik taksonomileri yapılmıştır. Farklı besi ortamlarındaki morfolojik, kültürel ve pigmentasyon özellikleri ile hücre duvarı diaminopimelik (DAP) ve yağ asiti kompozisyonuna göre karakterize edilen test organizmalarının Gram (+), Gram (–) bakterilerle küf ve mayalardan oluşan 17 patojene karşı antimikrobiyal aktiviteleri belirlenmiştir. Morfolojik ve pigmentasyon özelliklerine göre izolasyon plaklarından klad üyesi olarak seçilen izolatlar Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gen kladı için dizayn edilmiş klad spesifik S-S-Svio-66-A-S-18 ve A-S-Svio-1274-A-A-20 primerleri ile PCR amplifikasyonu bakımından test edilmiş ve bunlardan 37’sinin klad üyesi 21’inin ise klad üyesi olmadığı belirlenmiştir. Spor zincir ve spor yüzey şeklinin belirlenmesi için klad üyesi ve klad üyesi olmayan seçili bazı test organizmalarının Scanning Elektron Mikroskobu (SEM) araştırmasında klad üyesi izolatların, Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gen kladının karakteristik spor şekli olan spiral zincirli ve spor yüzeyleri rugoz ornomentasyonlu olduğu halde klad üyesi olmayan izolatların farklı spor morfolojileri gösterdikleri bulunmuştur. Klad üyesi tip türleri ile birlikte PCR amplifikasyonları yapılan test izolatlarının 16S rRNA’ları restriksiyon endonükleaz enzimleriyle kesilerek agaroz jelde elektroforez edildi. EcoR I, Pst I ve Sau3 AI restriksiyon endonükleaz enzimleri amplifiye edilen 16S rRNA’ları keserken BamH I ve Sal I restriksiyon endonükleaz enzimlerinde kesim gerçekleşmemiştir. Kesimi gerçekleştiren enzimler aynı sayıda ve eşit büyüklükte fragmentler oluşturduğundan suşlar arasında herhangi bir farklılaşma oluşmamıştır. RAPD-PCR fragmentleri bakımından M13f üniversal primeri ile PCR amplifikasyonları gerçekleştirilen test organizmalarında çalışılan tip türlerinin tamamı filogenetik analizlerle tam bir uyum göstererek birbirinden farklılaştığı halde izolat suşlarda önemli derecede farklılaşma olmasına rağmen filogenetik analizlerle aynı derecede tam bir uyum görülememiştir. NCBI, RDP-II RDP, DDBJ ve EMBL gibi databanklardan elde edilen Streptomyces tip örneği 16S rRNA nükleotid baz dizileri ile izolatların baz dizileri PHYDIT programında karşılaştırmalı olarak dizilenmiştir. 16S rRNA sekans analizi flogenetik dendogramları, least-squares, maximum-parsimony ve neighbour-joining algorithmleri ile oluşturulmuştur. Seçilmiş bazı test izolatlarının kendi aralarında ve nükleotid benzerliği en yüksek olan Streptomyces malaysiensis türü arasında florometrik yöntemle termal denatürasyon sıcaklığına bağlı olarak DNA-DNA ilişkisi belirlenmiş, rpo B, tuf A ve rec A gen bölgelerinin PCR amplifikasyon ürünleri ilgili forward ve reverse primerler ile sekansları gerçekleştirilerek MLST analizleri yapılmıştır. Streptomyces violaceusniger 16S rRNA gen kladı izolat suşlar arasında yüksek oranda 16S rRNA nükleotid benzerliğine rağmen elde edilen fenotipik, kimyasal ve moleküler taksonomik sonuçlardan, yüksek antimikrobiyal aktiviteli çok sayıda yeni türlerin literatüre kazandırılacağı anlaşılmaktadır.