Hepatit E virusu yapısal proteinlerinin (ORF2, ORF3) ekspresyonu, karakterizasyonu, klinik tanı ve aşı çalışmalarında kullanımı / Hakan Özdener; Danışman Cemil Çelik.

Abstract

Bu çalışmamızda, tropikal ve subtropikal bölge ülkelerinde milyonlarca insanın sağlığını etkileyen hepatit E virusunun (HEV), hindistan izolatının yapısal bölgeleri ORF2 ve ORF3'ün E.Coli'de, memeli hücrelerinde ve in-vitro eşleşmiş transkripsiyon-translasyon sisteminde ekspresyonu gerçekleştirildi. Eksprese proteinlerin immünoreaktiviteleri Western Blot analizi ile gösterilirken, insan ve laboratuvar hayvanlarında elde edilmiş poliklonal antikorlar immünopresipite edildi. Pürifiye eksprese proteinler, hepatit E virüs infeksiyonu tanısına yönelik Western Blot analizi geliştirme çalışmalarında kullanıldı. Anti-HEV ORF3 IgM antikorlarının akut HEV infeksiyonunda en güvenilir tanı markırı olduğu gösterildi. Mevcut serolojik tanı kitlerinde kullanılan pORF2'nin, farklı poliklonal antikorlar ile çapraz pozitif reaksiyonlar verdiği ve endemik ülke Hindistan'da sağlıklı insan kan numunelerinde %99 oranında kuvvetli pozitif ve hiç HEV infeksiyon seroprevelansı bildirilmemiş Küba'dan kan örnekleri ile ise zayıf ta olsa pozitif reaksiyon verdiği gösterildi. pORF2'nin hücre içinde sitoplazmada ve hücre duvarında lokalize olmasına karşılık, pORF3'ün ise sitoplazma ve hücre duvarı ile birlikte az miktarda da olsa nükleus içinde bulunduğu ve post- translasyonel modifikasyona girmediği gösterildi. pORF2 ve pORF3'nin iç türdeş ilişkisi incelenmesinde pORF3 sülfidril bağlarını kırıcı kimyasal maddeye ve ısıya karşı dayanıklı bir yapı gösterirken, pORF2'nin ısı (100 derecede 2 dakika) olmadan nonkovalent homodimerik bir kompleks yapıya sahip olduğu gösterildi. pORF2 ve pORF3'ün birbirleri ile karşılıklı ilişkilerinin incelenmesinde anti-pORF2 ve anti-pORF3 antikorlar ile yapılan immünopresipitasyondaçapraz (Cross) presipitasyon gözlenmemişken, antikorların yalnızca kendi spesifik proteinlerini presipite ettiği gösterilmiştir. pORF2'nin glikolize olmasına karşılık pORF3'ün fosforile olduğu gösterdik. Amino asit diziliminde tirozin amino asidi olmadığı bilinen pORF3'ün, fosfoaminoasid analizinde ''Serin'' amino asidinin fosforile olduğunu gösterdik. İn-vivo ve in-vitro olarak pORF3 ekspresyonu gerçekleştirilerek yapılan fosforilasyon deneylerinde ise ORF3 fosforilasyonunun hücre içi kinazlar ve otofosforilasyon sonucunda gerçekleşmediğini tesbit ettik.