Zwf mutant escherichia coli DF214 suşunun synechococcus sp.pcc 7942 zwf fragmentleriyle genetik komplementasyonu üzerine araştırmalar / Funda Erdem; Danışman Haydar Karakaya.

Abstract

Bu araştırmada Synechococcus sp. PCC 7942 zwf fragmentleri kullanılarak zwf mutant E. coli DF214 suşunun komplementasyonunun gerçekleştirilmesi hedeflenmiştir. Araştırmanın gerekçesi Synechococcus sp. PCC 7942 zwf geninin mutasyonal analizleri için etkili bir konak sistemi oluşturmaktır. 2.9 kb Synechococcus sp. PCC 7942 zwf fragmenti taşıyan pNUT1 rekombinant vektörü ile zwf mutant E. coli DF214 ve yabani tip E. coli JM109 hücreleri transforme edildi. Plazmitin kodladığı ampisilin direncinin takibi ve restriksiyon fragment analizleriyle transformasyonun doğru bir şekilde gerçekleştiği belirlendi. Transformant DF214 (SZD29) hücrelerinde yapılan analizlerde glukoz-6-fosfat dehidrojenaz (G6PDH) aktivitesine rastlanmadı. Yine transformant JM109 (SZJ29) hücrelerinde yapılan aktivete analizlerinde de yabani tip aktivitenin üzerinde ilave bir G6PDH aktivitesine rastlanmadı. Sonuçta Synechococcus sp. PCC7942 zwf geninin E. coli içinde ekspresyonunun gerçekleşemediğine karar verildi. Çalışmalar Synechococcus sp. PCC7942 zwf fragmentinin füzyon proteini şeklinde lac operonunun bir parçası olarak ekspresyonuna yöneltildi. Bunu gerçekleştirmek için zwf geninin başlangıç ve bitiş bölgeleriyle homolog olan ve geni lacZ' geninin okuma satırında tutacak bir fragment oluşturacak iki PCR primeri tasarlandı. Bu primerler kullanılarak 1.6 kilobazlık bir fragment şeklinde tam bir Synechococcus sp. PCC 7942 zwf geni PCR amplifikasyonu ile üretildi. Bu araştırmanın devamı olarak 1.6 kb zwf fragmentinin doğru pozisyonda pUC18 lacZ' içinde füzyon proteini olarak ekspresyonu gerçekleştirilebilir. Ayrıca fragment güçlü bir ekspreyon vektörü içinde büyük ölçekte üretilerek komplementasyon sağlanabilir.